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UHPLC與DAWN，UT-rEX聯(lián)用測(cè)定絕對(duì)分子量 已有2人參與
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尺寸排阻色譜（SEC）被廣泛用于表征生物大分子樣品中，聚集體或片段的尺寸和組成。傳統(tǒng)SEC要借助標(biāo)樣校正色譜柱，得到洗脫時(shí)間與分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是，這些標(biāo)樣常常與待測(cè)樣品的構(gòu)象相差甚遠(yuǎn)，或者待測(cè)樣與色譜柱填料之間有相互作用，這都會(huì)改變樣品的洗脫性質(zhì)（相較于標(biāo)樣）。SEC與光散射檢測(cè)器聯(lián)用，如miniDAWN TREOS，無(wú)需考慮洗脫時(shí)間，可測(cè)定樣品的絕對(duì)分子量。 超高效液相（UHPLC）可快速、有效的分離生物大分子樣品。與標(biāo)準(zhǔn)SEC相比，UHP-SEC的分辨率更高、工作效率更高 、溶劑消耗和樣品消耗更少，這對(duì)于珍貴的生物樣品來(lái)講是非常重要的。但事實(shí)證明，為標(biāo)準(zhǔn)HPLC設(shè)計(jì)的檢測(cè)器并不適用于UHPLC這一先進(jìn)技術(shù)。美國(guó)懷雅特技術(shù)公司的DAWN多角度激光光散射檢測(cè)器（MALS）和Optilab UT-rEX折光檢測(cè)器，專門為了UHPLC而設(shè)計(jì)，三者聯(lián)用可測(cè)定UHPLC系統(tǒng)中樣品的絕對(duì)分子量（或者摩爾質(zhì)量）以及尺寸大小。 對(duì)于一個(gè)給定的蛋白，一次完整的UHPLC分析可在5min內(nèi)完成（圖1，紅色曲線），而傳統(tǒng)的HPLC，一個(gè)樣品將花費(fèi)20min或者更長(zhǎng)的時(shí)間。兩種情況下，均使用了激光光散射儀和示差檢測(cè)器，測(cè)定每一個(gè)樣品峰的摩爾質(zhì)量。圖1 是標(biāo)準(zhǔn)的SEC-MALS系統(tǒng)和UHPLC-SEC-MALS系統(tǒng)測(cè)得的單體，二聚，以及多聚體的摩爾質(zhì)量以及色譜信號(hào)的疊加圖，其中SEC-MALS系統(tǒng)使用的是miniDAWN TREOS，Optilab T-rEX，而UHPLC-SEC-MALS系統(tǒng)使用的是DAWN和Optilab UT-rEX。為了更容易比較，將圖1上中的色譜圖轉(zhuǎn)化為分子量與柱體積的關(guān)系圖（圖1下）。每一個(gè)樣品峰對(duì)應(yīng)的摩爾質(zhì)量高度一致，這意味著可直接將現(xiàn)有的HPLC方法轉(zhuǎn)變成UHPLC方法，并保證得到同樣準(zhǔn)確，高質(zhì)量的分子量數(shù)據(jù)。 除了更快的分析時(shí)間，UHPLC較小的固定相粒徑，有助于提高聚集體和片段的分辨率，標(biāo)準(zhǔn)色譜柱和檢測(cè)器內(nèi)部的體積較大，引起色譜峰擴(kuò)散而導(dǎo)致峰展寬，這會(huì)使某一分辨率較低的樣品峰消失，例如圖2所示的片段（藍(lán)線）。DAWN最大程度上減小了系統(tǒng)的內(nèi)部體積，確保UHPLC洗脫圖譜的高分辨率，有助于我們檢測(cè)和分析以前未知的樣品。 圖2底部的圖譜中（紅色），樣品從UV進(jìn)入DAWN和Optilab UT-rEX，碎片峰被保留以便計(jì)算片段的分子量。因?yàn)樗械鞍椎恼酃庵笖?shù)增量（dn/dc）幾乎是恒定的，可根據(jù)該參數(shù)計(jì)算出樣品的濃度和摩爾質(zhì)量，而不必知道樣品峰的紫外消光系數(shù)。事實(shí)上，UV和RI檢測(cè)器聯(lián)用，可以測(cè)定每一個(gè)樣品峰的紫外消光系數(shù)并有助于鑒別它們。 DAWN不僅可測(cè)定樣品的絕對(duì)分子量，也可與UHPLC聯(lián)用實(shí)現(xiàn)所有深度分析。與標(biāo)準(zhǔn)HPLC-MALS一樣，可根據(jù)整個(gè)UHPLC-MALS樣品峰的分子量分布定量計(jì)算生物大分子的多分散度或者判斷蛋白寡聚物是否可逆。三檢測(cè)器UV，MALS和RI聯(lián)用，可進(jìn)行蛋白復(fù)合物分析，確定翻譯后修飾蛋白，與洗滌劑復(fù)合蛋白，藥物-蛋白復(fù)合物的數(shù)目或者其他多肽附加物的信息。 動(dòng)態(tài)光散射可選組件WYATT QELS 模塊可在進(jìn)行MALS測(cè)試的同時(shí)，測(cè)定樣品的流體力學(xué)半徑，三角度的miniDAWN檢測(cè)器的rms測(cè)定范圍是10-50nm，這點(diǎn)DAWN與其是一致的。這一套完整的檢測(cè)器意味著，我們可以充分利用UHPLC的高效率而不必犧牲數(shù)據(jù)質(zhì)量，且可與MALS聯(lián)用測(cè)定樣品的絕對(duì)分子量。 |
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