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淘七九懶鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
red同源重組做敲除時(shí) 電入片段后pcr無條帶？？
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如題，在大腸JM109中用red同源重組做敲除時(shí)，電入擴(kuò)增好的片段，然后PCR驗(yàn)證是否敲除成功。照理說無論是否敲除成功，都該有條帶的（若成功，該是1500bp;不成功，該是基因大�。？晌业腜CR結(jié)果是陽性對照（肯定含該基因的菌）都有基因大小的條帶，做了電擊的都沒有條帶。。。然后我提基因組驗(yàn)證，有的敲除成功，可是抗性一直消不掉。 有以下問題：我的pcr是用95度10min預(yù)變性，95度30s變性。而且陽性對照都出了很好的條帶，為甚么做了電擊的菌做菌落pcr就沒東西出來？而提了基因組又能有條帶的？為啥后面消抗老不長？？ |
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 敲除驗(yàn)證 |
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2樓2015-09-12 08:37:28
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| 樓主好，我現(xiàn)在也遇到了這樣的問題。就是做插入抗性進(jìn)行基因敲除，現(xiàn)在菌落PCR驗(yàn)證出了問題，具體是這樣：用kna雙引物a,b進(jìn)行菌落PCR，有目的條帶；用目的基因前后雙引物c,d（kan插入基因內(nèi)部）進(jìn)行菌落PCR，無任何條帶。以上實(shí)驗(yàn)用的是同樣的模板，同樣的延伸時(shí)間，在同一臺PCR儀中，也是同時(shí)做的。但是，沒有預(yù)想中的結(jié)果。之前用c,d以基因組為模板，是有條帶的，雖然特異性不太好，有雜帶，但是菌落PCR時(shí)無任何結(jié)果，我沒有想到原因。請問樓主后來問題解決了沒有 |
3樓2016-05-21 11:44:02
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