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QIIME--16s測序生物信息培訓課程(原創(chuàng)) 已有6人參與
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QIIME--16s測序生物信息培訓課程(原創(chuàng)) 名詞解釋 16S rRNA 16S rRNA 基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長度約為1542bp，其分子大小適中，突變率小，是細菌系統(tǒng)分類學研究中最常用和最有用的標志。其序列包含可變區(qū)（Variable region）和保守區(qū)（constant region）。可變區(qū)序列因細菌而異，且變異程度與細菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，通過提取環(huán)境樣品的DNA，并擴增和檢測其中的一段或幾段區(qū)域，可以了解環(huán)境樣品(土壤、腸道、海洋)中細菌的種類和豐度。 OTU 如果序列之間，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定義為一個OTU，每個OTU對應于一個不同的16S rRNA序列，也就是每個OTU對應于一個不同的細菌（微生物）種。通過OTU分析，就可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。 測序區(qū)域 由于16s rDNA較長（1.5kb），考慮到測序平臺的讀長限制，我們只能對可變區(qū)進行測序。16s rDNA包含有9個可變區(qū)，分別是v1-v9。一般我們對v3，v3-v4和v6可變區(qū)域進行擴增和測序。 主要內(nèi)容 QIIME安裝 測序數(shù)據(jù)處理 OTU分析與注釋 Venn圖繪制 Heatmap圖繪制 樣品復雜度分析 (Alpha diversity) 多樣品比較分析 (Beta diversity) 系統(tǒng)樹的構(gòu)建 其他分析 詳細內(nèi)容 1.Qiime的安裝(http://qiime.org/) 在http://qiime.org/官網(wǎng)下載VirtualBox和QIIME虛擬機，然后安裝VirtualBox，導入QIIME虛擬機，具體圖示如下。  我的電腦為什么安裝不了？那是因為您的電腦可能沒有開通VT(virtualization technology)，趕緊進入BIOS開通吧。 2.Linux常見命令 大家如果沒有用過linux的話，請學會一下幾個常用的linux命令吧。如果大家想對我們的課程有詳細的詳解的話，大家可以在掏寶搜索“16s測序分析”就能找到我們的課程了。 cd 切換到目錄 pwd 顯示當前目錄完整路徑 mkdir/touch 新建目錄/文件 ls 查看文件與目錄 cp 復制文件 mv 移動文件、目錄或更名 rm 刪除文件或目錄 zip/tar 解壓縮文件 history 查看歷史命令 wget 命令行的下載工具 shutdown/reboot 關(guān)機/重啟 3.FASTQ數(shù)據(jù)下載 主要有以下兩個網(wǎng)站下載原始的FASTQ： EBI (http://www.ebi.ac.uk/) SRA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) 4.樣品信息文件(map.txt) #SampleID BarcodeSequence LinkerPrimerSequence SampleType Description SRR1370913 AGCTGACTAGTC GTGCCAGCMGCCGCGGTAA tumor SRR1370913 SRR1370914 AGCTGACTAGTG GTGCCAGCMGCCGCGGTAA tumor SRR1370914 SRR1370915 AGCTGACTAGTA GTGCCAGCMGCCGCGGTAA normal SRR1370915 SRR1370920 AGCTGACTAGTT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA normal SRR1370920 第一列必須是#SampleID，為可區(qū)分的數(shù)字，字母或 。每一行的這個值應該是唯一的。 第二列必須為BarcodeSequence。每一行的這個值應該是唯一的。 第三列必須為LinkerPrimerSequence，為擴增樣品的引物。 后面的列可以根據(jù)樣品的特點加以描述，但是每一列必須包含至少兩個值，就是指定樣品信息，就可以在這個位置設(shè)置了。 最后一列必須是Description。每一個樣品不一樣的地方，必須不一樣額。 5.join_paired_ends.py (fastq-join) 6.質(zhì)量過濾 (split_libraries_fastq.py) convert to fasta Read too short after quality truncation N characters 7.OTU分析與注釋--pick_open_reference_otus.py pick_otus.py------從fasta文件中提取OTUs，提取方法有cd-hit，blast，Mothur，usearch。 make_otu_table.py-------將提取出的OTUs制作成out_table，即.biom文件。 assign_taxonomy.py------使用reference中的reference_seqs和 taxonomy文件對序列分類。 biom add-metadata-------將taxa數(shù)據(jù)加入到.biom文件。 8.Venn圖繪制 使用VennDiagram package可以輕松獲得和高水平文章上類似的Venn（維恩）圖，代碼如下： 9.Heatmap圖 10.core_diversity_analyses.py（Alpha和Beta分析） single_rarefaction.py------Rarify the OTU table beta_diversity.py-------beta多樣性 principal_coordinates.py------PCoA圖形化 alpha_diversity.py-------Alpha多樣性 make_rarefaction_plots.py-------稀釋曲線 summarize_taxa.py------Summarize Taxonomy plot_taxa_summary.py------Taxa summary plots Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量指標有Chao1 豐富度估計量（Chao1 richness estimator） 、香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）、辛普森多樣性指數(shù)（Simpson diversity index）等。 計算菌群豐度：Chao； 計算菌群多樣性：Shannon、Simpson。 Chao1：是用chao1 算法估計群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)，chao1 在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)，由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物種總數(shù)越多。 計算公式：Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1) Shannon-Wiener 曲線，是利用shannon指數(shù)來進行繪制的，反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。 當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。 Simpson：用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，在生態(tài)學中常用來定量的描述一個區(qū)域的生物多樣性。Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。 Rank-Abundance曲線：同時解釋樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。橫坐標代表物種排序的數(shù)量；縱坐標代表觀測到的相對豐度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。而曲線快速陡然下降表明樣本中的優(yōu)勢菌群所占比例很高，多樣性較低。 Beta多樣性是生態(tài)系之間的種多樣性，它包含分類單位的比較生態(tài)系內(nèi)的每一獨特性。即衡量群落之間的差別。Beta多樣性不僅描述生境內(nèi)生物種類的數(shù)量，同時也考慮到這些種類的相同性及其彼此之間的位置。不同生境間或某一生態(tài)梯度上不同地段間生物種類的相似性越差，Beta生物多樣性越高。 PCoA分析，即主坐標分析（PCoA，Principal Coordinate Analysis）可以從復雜的多維度數(shù)據(jù)中提取和可視化展示主要的高信息量突變,與PCA的主要思想類似。它將距離矩陣的信息轉(zhuǎn)變成在一系列直交軸中顯示，這樣某種變量的最大值體現(xiàn)在第一個成分坐標中，而另一種變量的最大值體現(xiàn)在另一個成分坐標上。距離越近的點代表樣本間相似度越高，理論上生物學重復的樣本應該聚在一起。 11.系統(tǒng)樹 系統(tǒng)發(fā)生樹（英文：phylogenetic tree或evolutionary tree）是表明被認為具有共同祖先的各物種相互間演化關(guān)系的樹，又被稱為系統(tǒng)發(fā)育樹、系統(tǒng)演化樹、系統(tǒng)進化樹、種系發(fā)生樹、演化樹、進化樹、系統(tǒng)樹。 它用來表示系統(tǒng)發(fā)生研究的結(jié)果，用它描述物種之間的進化關(guān)系。 filter_otus_from_otu_table.py------挑選豐度>1‰的OTU filter_fasta.py------獲得豐度>1‰OTU的fasta文件 make_phylogeny.py-------構(gòu)建系統(tǒng)樹 ggtree.R------系統(tǒng)樹可視化 為了更好的展示系統(tǒng)樹，我們采用了最新的ggtree R包實現(xiàn)系統(tǒng)樹的可視化。我們主要展示兩個系統(tǒng)樹，即circos樹和熱圖樹。ggtree.R代碼如下： 12.差異OTU分析 對找到的OTU，我們會分析其在各個樣品中的豐度，分析每個OTU在對照組和實驗組中的差異情況。 OTU baseMean log2FoldChange stat pvalue padj taxonomy 1787644 44.801 4.315 4.364 1.28E-05 0.012 k__Bacteria; p__Cyanobacteria; c__Chloroplast; o__Streptophyta; f__; g__; s__ 539866 68.372 4.198 4.058 4.95E-05 0.028 k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteobacteria; o__Thiotrichales; f__Piscirickettsiaceae; g__; s__ 特別聲明，此文章是作者原版，如需要轉(zhuǎn)載，請與作者聯(lián)系。大家如果對該課程該興趣，可以查看作者的用戶名，也可以在掏寶搜索“16s測序分析視頻”或者“生物信息視頻”。 1.png 2.png 3.png 4.png 5.png 6.png 7.png 8.png 9.png 10.png 11.png 12.png 13.png 14.png 15.png 16.png 17.png 18.png 19.png 20.png 21.png 22.png 23.png 24.png 25.png 26.png 27.png 28.png |
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