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5150416新蟲 (小有名氣)
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[交流]
PCR目的基因
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問一下大家在PCR時(shí)候有沒有遇到像我這樣的情況，就是怎么p就是p不出來，引物是重新?lián)Q的，還是p不出來，你們將退貨溫度調(diào)到比設(shè)計(jì)的高多少或少多少，大家有木有好的方法，還請(qǐng)大家給個(gè)建議，謝謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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退火溫度:55-65，有段時(shí)間我的pcr也是怎么也p不出來，后來加大了模板濃度，才過得pcr產(chǎn)物，或者更換好一點(diǎn)的酶試試。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-09-07 07:51:25
18761615793
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5150416: 金幣+5 2015-09-07 09:53:40
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哎~ 首先確定你的模板有沒有降解，提取多長(zhǎng)時(shí)間了 其次引物不是換新的就可以的，引物特異性需要驗(yàn)證 然后關(guān)于酶，不知道你的目的片段大小多少，GC含量如何，建議先看看如何選酶根據(jù)大小和下游應(yīng)用選擇 http://www.detaibio.com/dna-taq-polymerase.html，一般的熱啟動(dòng)聚合酶能夠滿足擴(kuò)增， 最好按照酶的說明書設(shè)置反應(yīng)條件和配置反應(yīng)體系，一般不是一次成功的話，摸索退火溫度，如果雜帶多，升高退火溫度如果沒有條帶可降低退火溫度，另外根據(jù)目的片段大小配置合適膠濃度，，，太多了具體的看看一下文檔吧 有問題解決和提高特異性的方法總結(jié)，還有一篇是關(guān)于操作的，有很多注意的點(diǎn) http://www.detaibio.com/topics/pcr-sop.html http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html |
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6樓2015-09-07 09:36:02
jl.liu
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10樓2015-09-07 09:55:48
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