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[交流]
做細(xì)菌的熒光定量PCR，SYBR GREEN I 染料，提取的是DNA，選擇什么內(nèi)參比較好？
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| 如題，GAPDH，β-actin 還是18s rRNA？這些內(nèi)參可以買到嗎？謝謝！ |
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13樓2015-09-11 23:25:17
xiaochong8693
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hutingting
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6樓2015-09-10 11:40:37
7樓2015-09-10 12:54:53
hutingting
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不太明白你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘裁�？是鑒定細(xì)菌種類？還是檢測三種細(xì)菌中哪一種中某個(gè)基因的表達(dá)量高低？我的實(shí)驗(yàn)是檢測不同菌株中某一基因的mRNA水平的高低，所以提取總RNA，oligo dT引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以一株細(xì)菌檢測為例，cDNA為模板，一管realtime pcr反應(yīng)中加入目的基因擴(kuò)增引物，對照則是另一管realtimepcr反應(yīng)中加入16S引物，確定這兩對擴(kuò)增效率都在100%的前提下，通過CT值之比，得出各株之間相對mRNA水平 |
8樓2015-09-10 13:59:05
hutingting
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9樓2015-09-10 14:03:56
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根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。 也可用geNorm內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。 對于比較精確的實(shí)驗(yàn)，最好采用兩種或兩種以上表達(dá)穩(wěn)定的基因作內(nèi)參，對每種內(nèi)參基因測得的基因表達(dá)變化求方差和平均值。 |
10樓2015-09-10 16:17:36
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