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loveming313

新蟲 (小有名氣)

[交流] 請大家?guī)蛶兔�，這個(gè)PCR程序是什么意思？如何在PCR儀上設(shè)置？

請大家?guī)蛶兔Γ@個(gè)PCR程序是什么意思？如何在PCR儀上設(shè)置？
1.這是屬于跳躍PCR ,還是什么?
2.這種PCR用普通taq酶可以P嗎？
3.在PCR儀上如何設(shè)置這個(gè)程序？
4.PCR程序中變性、退火、延伸的反應(yīng)時(shí)間是怎么確定的？和哪些因素（如酶、擴(kuò)增片段、模板）有關(guān)？

請大家?guī)蛶兔�，這個(gè)PCR程序是什么意思？如何在PCR儀上設(shè)置？
搜狗截圖15年09月09日PCR程序.png
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梟翔

金蟲 (正式寫手)
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5樓: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 08:05:51
是的，第9部是28個(gè)循環(huán)
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是這個(gè)網(wǎng)站上的鑒定程序，

2.這種PCR用普通taq酶可以P嗎？
3.在PCR儀上如何設(shè) ...

第一個(gè)問題，可以用普通的rTaq酶。
第二個(gè)問題，不知道你們PCR儀器是哪個(gè)公司的，你可以看看說明書。
第三個(gè)問題，變性是根據(jù)你的酶設(shè)定的、退火溫度是是根據(jù)你的引物TM確定的，延長時(shí)間是根據(jù)你擴(kuò)增片段大小來確定的。
附加：為什么用touchdown呢？是因?yàn)楫?dāng)你不確定引物的最佳退火溫度的時(shí)候，可以從65度向下降，當(dāng)退火溫度高的時(shí)候，只有特異性條帶，退火溫度依次降低，那么非特異性條帶可能就會出現(xiàn)。這時(shí)候，前面10個(gè)降落循環(huán)中，PCR產(chǎn)物肯定會有你的特異性條帶，所以第二個(gè)延伸28個(gè)循環(huán)，然后在某一個(gè)確定退火溫度下，這時(shí)候引物就會以你的特異性條帶結(jié)合，然后PCR結(jié)束以后，你的目的條帶才是比較亮的。
7樓2015-09-10 09:57:34
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★
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touchdown不就是你平時(shí)怎么P還怎么P，程序多一段每循環(huán)降溫么？你要是儀器不支持，或者找不到會的人，一個(gè)個(gè)循環(huán)自己輸也行嘛。問這么久輸都輸完了。
Biorad，ABI的機(jī)器都有oC/cycles選項(xiàng)，自己找
10樓2015-09-10 13:08:22
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梟翔

金蟲 (正式寫手)
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9樓: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 11:28:45
1.我用的酶是Thermo家的Taq DNA Polymerase
2.那這個(gè)變性、退火、延伸的反應(yīng)時(shí)間怎么確定的？擴(kuò)增的片段大小分別是666bp和850bp
3.能不能幫忙設(shè)計(jì)一下PCR反應(yīng)條件，拜托了
這個(gè)圖就是PCR鑒定程序

021302.png
...

如果你的目的是目的基因表達(dá)的話，需要換一個(gè)高保真的酶，Taq不行。

1    95°          5min
2    95°          30s
3    65°          30s
4    72°          1min
第二步到第四步10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降低1°
5    95°          30s
6    55°          30s
7    72°          1min
第五步到第七步25個(gè)循環(huán)
8    72°          10min
9    10°          ∞

這個(gè)程序是以前用過的Taq酶的touchdown，你可以參考一下

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11樓2015-09-10 13:34:14
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普通回帖

顧在

新蟲 (初入文壇)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
你這是做什么實(shí)驗(yàn)用的呢，循環(huán)數(shù)也沒有，退火溫度是與引物相關(guān)，而延伸時(shí)間與擴(kuò)增片段大小相關(guān)，大概只知道是兩步pcr
2樓2015-09-09 17:42:10
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梟翔

金蟲 (正式寫手)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
降落PCR，第5步應(yīng)該10個(gè)循環(huán)，第9步應(yīng)該25個(gè)循環(huán)。
3樓2015-09-09 18:51:40
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
2樓: Originally posted by 顧在 at 2015-09-09 17:42:10
你這是做什么實(shí)驗(yàn)用的呢，循環(huán)數(shù)也沒有，退火溫度是與引物相關(guān)，而延伸時(shí)間與擴(kuò)增片段大小相關(guān)，大概只知道是兩步pcr

是突變型小鼠鑒定用的，擴(kuò)增片段為850bp 和666bp,循環(huán)數(shù)第一個(gè)是10，第二個(gè)是28.
我不知道第4部后面0.5C per cycle 是什么意思？
4樓2015-09-10 08:01:25
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
3樓: Originally posted by 梟翔 at 2015-09-09 18:51:40
降落PCR，第5步應(yīng)該10個(gè)循環(huán)，第9步應(yīng)該25個(gè)循環(huán)。

是的，第9部是28個(gè)循環(huán)
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是這個(gè)網(wǎng)站上的鑒定程序，

2.這種PCR用普通taq酶可以P嗎？
3.在PCR儀上如何設(shè)置這個(gè)程序？
4.PCR程序中變性、退火、延伸的反應(yīng)時(shí)間是怎么確定的？和哪些因素（如酶、擴(kuò)增片段、模板）有關(guān)？
5樓2015-09-10 08:05:51
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
2樓: Originally posted by 顧在 at 2015-09-09 17:42:10
你這是做什么實(shí)驗(yàn)用的呢，循環(huán)數(shù)也沒有，退火溫度是與引物相關(guān)，而延伸時(shí)間與擴(kuò)增片段大小相關(guān)，大概只知道是兩步pcr

https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是這個(gè)網(wǎng)站上的鑒定程序
6樓2015-09-10 08:07:11
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kodey

木蟲 (著名寫手)
★
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Touchdown PCR，循環(huán)數(shù)不夠呀，PCR儀都可以設(shè)置Touchdown PCR，現(xiàn)在一般的Taq酶都可以做Touchdown。
8樓2015-09-10 09:57:43
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
7樓: Originally posted by 梟翔 at 2015-09-10 09:57:34
第一個(gè)問題，可以用普通的rTaq酶。
第二個(gè)問題，不知道你們PCR儀器是哪個(gè)公司的，你可以看看說明書。
第三個(gè)問題，變性是根據(jù)你的酶設(shè)定的、退火溫度是是根據(jù)你的引物TM確定的，延長時(shí)間是根據(jù)你擴(kuò)增片段大小來確 ...

1.我用的酶是Thermo家的Taq DNA Polymerase
2.那這個(gè)變性、退火、延伸的反應(yīng)時(shí)間怎么確定的？擴(kuò)增的片段大小分別是666bp和850bp
3.能不能幫忙設(shè)計(jì)一下PCR反應(yīng)條件，拜托了
這個(gè)圖就是PCR鑒定程序
請大家?guī)蛶兔�，這個(gè)PCR程序是什么意思？如何在PCR儀上設(shè)置？-1
021302.png
9樓2015-09-10 11:28:45
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
送紅花一朵
引用回帖:
11樓: Originally posted by 梟翔 at 2015-09-10 13:34:14
如果你的目的是目的基因表達(dá)的話，需要換一個(gè)高保真的酶，Taq不行。

1    95°          5min
2    95°          30s
3    65°          30s
4    72°          1min
第二步到第四步10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降低 ...

你好，謝謝你的建議，我稍微修改了下：每循環(huán)降低0.5℃（即退火溫度從65—60），現(xiàn)在能跑出666bp的野生型條帶【如圖，Marker為DL100】；但850bp的條帶P不出來，很讓人著急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC TTG GCT ACC AGA，后引物TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT（后引物是共用的）
850bp目的片段的前引物是TGC CTG CTC TTT ACT GAA GG，后引物是TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT，這個(gè)擴(kuò)增條件怎么設(shè)呢？
請大家?guī)蛶兔�，這個(gè)PCR程序是什么意思？如何在PCR儀上設(shè)置？-2
搜狗截圖15年09月19日1420_2.png
12樓2015-09-19 14:20:53
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
10樓: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-10 13:08:22

touchdown不就是你平時(shí)怎么P還怎么P，程序多一段每循環(huán)降溫么？你要是儀器不支持，或者找不到會的人，一個(gè)個(gè)循環(huán)自己輸也行嘛。問這么久輸都輸完了。
Biorad，ABI的機(jī)器都有oC/cycles選項(xiàng)，自己找

大俠你好，我現(xiàn)在能跑出666bp的野生型條帶【如圖，Marker為DL100】；但850bp的條帶P不出來，很讓人著急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC TTG GCT ACC AGA，后引物TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT（后引物是共用的）
850bp目的片段的前引物是TGC CTG CTC TTT ACT GAA GG，后引物是TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT，這個(gè)擴(kuò)增條件怎么設(shè)呢？
我實(shí)在是愚笨，煩請您給個(gè)建議吧
請大家?guī)蛶兔�，這個(gè)PCR程序是什么意思？如何在PCR儀上設(shè)置？-3
搜狗截圖15年09月19日1420_2.png
13樓2015-09-19 14:29:03
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lini-828127

木蟲 (小有名氣)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
這就是這touchdown pcr，bio-rad等好多機(jī)子，在設(shè)置第三步的時(shí)候選擇溫度降落就可以了。
15樓2015-09-20 00:30:21
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
15樓: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 00:30:21
這就是這touchdown pcr，bio-rad等好多機(jī)子，在設(shè)置第三步的時(shí)候選擇溫度降落就可以了。

謝謝回復(fù)，我知道怎么PCR，是想麻煩蟲友是否能夠?qū)?50bp目的擴(kuò)增條帶，引物如上所說，提供一些反應(yīng)條件的建議

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16樓2015-09-20 08:01:44
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葉舒舒

新蟲 (初入文壇)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
設(shè)置降落pcr，退火溫度一般用TM加5，前10個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)降0.5℃，你這么短的片段，用普通taq酶也不會有問題

發(fā)自小木蟲Android客戶端
17樓2015-09-20 08:17:53
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葉舒舒

新蟲 (初入文壇)
擴(kuò)不出來是不是前后引物tm值相差過大，或者前引物不好連接，可以把前引物重新設(shè)計(jì)

發(fā)自小木蟲Android客戶端
18樓2015-09-20 08:23:27
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梟翔

金蟲 (正式寫手)
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引用回帖:
12樓: Originally posted by loveming313 at 2015-09-19 14:20:53
你好，謝謝你的建議，我稍微修改了下：每循環(huán)降低0.5℃（即退火溫度從65—60），現(xiàn)在能跑出666bp的野生型條帶【如圖，Marker為DL100】；但850bp的條帶P不出來，很讓人著急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC  ...

重新檢查一下引物，是不是有錯(cuò)誤
19樓2015-09-20 11:16:59
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lini-828127

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引用回帖:
16樓: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
謝謝回復(fù)，我知道怎么PCR，是想麻煩蟲友是否能夠?qū)?50bp目的擴(kuò)增條帶，引物如上所說，提供一些反應(yīng)條件的建議
...

850bp的話建議變性30s，退火30s，延伸時(shí)間60s，溫度按所使用的酶定。

發(fā)自小木蟲Android客戶端
20樓2015-09-20 12:13:51
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lini-828127

木蟲 (小有名氣)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
引用回帖:
16樓: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
謝謝回復(fù)，我知道怎么PCR，是想麻煩蟲友是否能夠?qū)?50bp目的擴(kuò)增條帶，引物如上所說，提供一些反應(yīng)條件的建議
...

你看看是不是引物有問題，或者是模板，可以換個(gè)模板試試，檢測一下引物是否有問題

發(fā)自小木蟲Android客戶端
21樓2015-09-20 12:16:38
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loveming313

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引用回帖:
20樓: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 12:13:51
850bp的話建議變性30s，退火30s，延伸時(shí)間60s，溫度按所使用的酶定。
...

哎，沒有及時(shí)看帖子，我已經(jīng)用變性30s,退火60s，延伸60s,進(jìn)行退火57±7℃梯度PCR了，祈禱有條帶出來呀
弱弱地問一句，退火的時(shí)間跟什么有關(guān)
22樓2015-09-20 15:01:27
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lini-828127

木蟲 (小有名氣)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
貌似是和引物與序列匹配有關(guān)

發(fā)自小木蟲Android客戶端
23樓2015-09-21 00:13:29
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loveming313

新蟲 (小有名氣)
又出現(xiàn)問題了，只能P出666bp野生型條帶，P不出850bp條帶
24樓2016-01-21 16:35:00
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簡單回復(fù)
2015-09-19 17:47   回復(fù)  
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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