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learningying鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
Weatern Blotting實驗用ECL顯色請求指導
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Weatern Blotting實驗用ECL顯色請求指導，背景一直很深，有時候整個膜都沒有辦法拍照，我們用的是ECL染色，然后選擇感光照片進行顯影，但是結(jié)果如下，請指正。具體的實驗過程如下： Sample Text 蛋白樣品制備 ：按照常規(guī)的方法進行，蛋白可溶。 蛋白濃度測定：BCA蛋白濃度測定試劑盒 上樣量30ug，大約體積是3ul。 (3) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 先使用80 V恒壓電泳約40min，觀察到溴酚藍進入分離膠界面的時候使用120V恒壓電泳80min后，當溴酚藍到達膠的底端處附近停止電泳。 （4）轉(zhuǎn)膜. 恒壓15V轉(zhuǎn)移30min，可以看到Marker 條帶清晰，分散開來。 （5）封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束，PBST中，漂洗3次，每次5 min，以便洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。 吸盡轉(zhuǎn)膜液，加入Western封閉液(購自碧云天)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動，室溫封閉60min或4℃封閉過夜。 （6）免疫染色 稀釋一抗 1:1000 ；二抗 1:5000;加入PBST，加入PBST洗膜3次，每次15min。 （7）ECL發(fā)光顯色 1.在暗室里將ECL試劑盒中的A液和B液等體積充分混勻。 2，將ECL混合液體覆蓋到PVDF上吸附了蛋白的一面，室溫下(25℃)反應1min，用平頭鑷鉗住PVDF膜淋去多余的液體。 3.暗室中將PVDF膜置于壓片盒中的兩層保鮮膜中間，其中吸附有蛋白質(zhì)的一面朝上，平整地放置在壓片盒中。 4.將曝光的膠片放在顯影液中顯影3min，經(jīng)過清水沖洗除去顯影液后將膠片浸沒在定影液中1min。 |
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8樓2015-09-16 16:01:32
kobe199613
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感覺顯影時間有點長啊，很久不做了，也不是很確定了，還有就是拍照的時候曝光時間，過長的話背景也會很深。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-09-16 09:39:19
3樓2015-09-16 10:49:17
learningying
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4樓2015-09-16 10:56:26
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