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learningying鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
Weatern Blotting實(shí)驗(yàn)用ECL顯色請(qǐng)求指導(dǎo)
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Weatern Blotting實(shí)驗(yàn)用ECL顯色請(qǐng)求指導(dǎo)，背景一直很深，有時(shí)候整個(gè)膜都沒有辦法拍照，我們用的是ECL染色，然后選擇感光照片進(jìn)行顯影，但是結(jié)果如下，請(qǐng)指正。具體的實(shí)驗(yàn)過程如下： Sample Text 蛋白樣品制備 ：按照常規(guī)的方法進(jìn)行，蛋白可溶。 蛋白濃度測(cè)定：BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上樣量30ug，大約體積是3ul。 (3) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 先使用80 V恒壓電泳約40min，觀察到溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠界面的時(shí)候使用120V恒壓電泳80min后，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近停止電泳。 （4）轉(zhuǎn)膜. 恒壓15V轉(zhuǎn)移30min，可以看到Marker 條帶清晰，分散開來。 （5）封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束，PBST中，漂洗3次，每次5 min，以便洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。 吸盡轉(zhuǎn)膜液，加入Western封閉液(購自碧云天)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60min或4℃封閉過夜。 （6）免疫染色 稀釋一抗 1:1000 ；二抗 1:5000;加入PBST，加入PBST洗膜3次，每次15min。 （7）ECL發(fā)光顯色 1.在暗室里將ECL試劑盒中的A液和B液等體積充分混勻。 2，將ECL混合液體覆蓋到PVDF上吸附了蛋白的一面，室溫下(25℃)反應(yīng)1min，用平頭鑷鉗住PVDF膜淋去多余的液體。 3.暗室中將PVDF膜置于壓片盒中的兩層保鮮膜中間，其中吸附有蛋白質(zhì)的一面朝上，平整地放置在壓片盒中。 4.將曝光的膠片放在顯影液中顯影3min，經(jīng)過清水沖洗除去顯影液后將膠片浸沒在定影液中1min。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
learningying: 金幣+1, ★有幫助 2015-09-16 10:23:41
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
learningying: 金幣+1, ★有幫助 2015-09-16 10:23:41
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感覺顯影時(shí)間有點(diǎn)長啊，很久不做了，也不是很確定了，還有就是拍照的時(shí)候曝光時(shí)間，過長的話背景也會(huì)很深。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-09-16 09:39:19
3樓2015-09-16 10:49:17
learningying
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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4樓2015-09-16 10:56:26
5樓2015-09-16 11:36:48
【答案】應(yīng)助回帖
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learningying: 金幣+164, ★★★很有幫助 2015-09-16 19:35:15
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可以參考里面的解決方法，或者看看其他公司的western blot trouble shooting |
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2015-09-16 11:50:23, 5.64 M
6樓2015-09-16 11:52:24
諸葛小汐
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7樓2015-09-16 13:34:21
learningying
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8樓2015-09-16 16:01:32
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