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小白鼠搞科研新蟲 (初入文壇)
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[交流]
質(zhì)粒構(gòu)建問題，求大神幫忙看看 已有5人參與
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| 本人構(gòu)建質(zhì)粒，載體是PGL3-basic,酶切位點(diǎn)Kpn1 ,Xho1,插入片段600bp,普通PCR條帶很亮，酶切連接純化濃度都不低，也適當(dāng)提高片段濃度，涂板菌落長得很好，菌液PCR有條帶很亮，但是一測(cè)序用普通PCR引物就沒有信號(hào)，通用引物顯示空載，雙酶切檢測(cè)也顯示沒有連上，求大神指導(dǎo)下到底哪里出錯(cuò)了。 |
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evangelina
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2樓2015-09-19 21:41:40
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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| 涂板長得很好很多不能代表確實(shí)是連接產(chǎn)物，涂板時(shí)做control了嗎？沒有的話，長得很多有可能是自連呢。還有在連接時(shí)載體可以提前做一下去磷酸化處理。“菌落PCR有條帶很亮”你做菌P時(shí)用的引物是什么引物，不會(huì)是在P目的片段時(shí)的所用的primer吧，如果真是用的P目的片段時(shí)的primer，就是真P出來了，也不能說明確實(shí)連接上了，所以建議菌P時(shí)用載體上的引物。回收的時(shí)候雖然濃度不低，但是最好跑膠看一下到底有沒有真回收回來。 |
3樓2015-09-19 22:50:39
renzhiq
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4樓2015-09-19 23:03:51
5樓2015-09-20 00:44:33
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6樓2015-09-22 18:07:21
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