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kangaroo0513新蟲 (正式寫手)
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[求助]
哪位帥哥有“WB600枯草菌”和“PAX01質�！钡脑敿毑僮髡f明書？ 已有1人參與
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或者使用手冊？？悄悄賜一個給我唄。。 以前沒做過枯草，真心求詳細protocol。。。 順便請教，pAX01的MCS是不是用BamHI？然后，插入的方向是正向還是反向？網(wǎng)上給出的Pxyl promoter是反向的，但是把序列拷到snapgege里，發(fā)現(xiàn)那有個正向的Amp promoter。。于是就凌亂了。。。另外，如果是BamHI單酶切的話，需不需要加額外的SD序列和分泌信號肽？還是pAX01自身就帶了分泌信號肽和SD序列了？ 1111.png 1112.png |
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dorecnu
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
kangaroo0513: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-09-28 14:53:48
感謝參與，應助指數(shù) +1
kangaroo0513: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-09-28 14:53:48
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1. 從第一張圖上看該質粒的MCS是not1,sacI,sacI,bamHI 2. 插入方向可以通過設計雙酶切位點確定，改變待插入基因啟動子和終止子的酶切位點即可確定克隆片段的插入方向。如果使用單酶切位點本身不能確定片段插入方向，但可以在后續(xù)的篩選中，通過測序篩選自己理想的片段插入方向，只是這樣成本略高，不建議使用。如果只有bamhI可用，記得在單酶切鏈接的時候，使用堿性磷酸酶將載體去磷酸化防止載體自連接。 3. 從樓主問問的的方式來看，樓主應該是有pax01質粒的序列的，所以是否需要加入SD序列和信號肽，可以拿起始密碼子上游10個堿基分析一下是否富含嘌呤即可，信號肽也的分析也是一樣，都有載體序列了這些不是一看就知道嗎？ 4. 至于啟動子方向那就更簡單了，不管軟件的分析結果，拿載體序列，分析起始密碼子上游和下游系列，看是否都存在啟動子典型的-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”和-10區(qū)“TTGACATATATT”相近的序列及AGGAGG核糖體結合位點（新手可以使用http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm幫助一下預測），如果雙向都有，建議用PxyA作為啟動子。 5. 據(jù)我的經(jīng)驗該質粒應該不自帶外分泌信號肽，這個很好解決，在設計插入基因時，自己加入一段就可以了。 祝實驗順利！ |
2樓2015-09-28 09:51:32
kangaroo0513
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感謝。。。我上傳個gb格式的序列文件，您幫我瞧一下具體有莫有信號肽和RBS？我的初步判斷也是沒有，但是由于第一次折騰枯草，不敢大意。。另外，如果我要用枯草表達一個人源的蛋白酶前體（本身帶信號肽，用于定位酸性囊泡），我可以在N端再加一個分泌的信號肽讓枯草把這個蛋白酶前體分泌出去不？如果可以的話，依您的經(jīng)驗是哪個信號肽效果會好一些？ |
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2015-09-28 12:24:12, 12.4 K
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3樓2015-09-28 12:27:01
4樓2018-01-20 10:29:22
kangaroo0513
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5樓2018-01-22 08:42:15
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