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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » DNA重組 » 畢赤酵母高拷貝篩選
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[求助]
畢赤酵母高拷貝篩選 已有2人參與
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如題，本人新手，做蛋白分子改造的，之前將目的基因構建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博萊霉素篩選高拷貝，濃度達到1ug/ml，菌落PCR后挑取陽性菌落搖瓶表達，結果表達量極低�，F(xiàn)在改變策略構建到pPIC9K上用G418篩選高拷貝，想問問各位達人G418能不能和氨芐同時使用，因為之前做的時候涂布His+轉(zhuǎn)化子的G418平板老是不長酵母而長雜菌。另外還想問問是不是帶有his tag的蛋白酵母的表達量會降低？因為我想要拿比較高表達量的菌株對該蛋白進行表征。有文獻建議His+轉(zhuǎn)化子不經(jīng)過G418篩選高拷貝而直接以深孔板培養(yǎng)篩選高表達量菌株，各位覺得哪種方法更靠譜呢？在同一個梯度的平板上，各菌株的表達量差異會否很大？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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 蛋白表達純化鑒定精華 |
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3樓2015-10-05 00:25:14
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
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梯度加壓，增加zeocin濃度，篩選到2000的濃度，調(diào)取克隆進行表達小試進一步篩選。根據(jù)經(jīng)驗，高濃度板子上長出來的克隆表達量不見得高，曾有過不表達的情況。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-10-05 00:11:58
4樓2015-10-05 12:29:11
送紅花一朵 |
謝謝你，還想問問搖瓶是擋板瓶還是普通的呢？因為實驗室搖床無法到300rpm，最多到200rpm，害怕溶氧不行。我想做小一點的，50ml一個。選幾個比較合適啊？因為我最高濃度的平板上也有接近50個�？偛荒芏继舭伞�。。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2015-10-05 12:36:22
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