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[求助]
畢赤酵母高拷貝篩選 已有2人參與
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如題，本人新手，做蛋白分子改造的，之前將目的基因構(gòu)建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博萊霉素篩選高拷貝，濃度達(dá)到1ug/ml，菌落PCR后挑取陽性菌落搖瓶表達(dá)，結(jié)果表達(dá)量極低�，F(xiàn)在改變策略構(gòu)建到pPIC9K上用G418篩選高拷貝，想問問各位達(dá)人G418能不能和氨芐同時(shí)使用，因?yàn)橹白龅臅r(shí)候涂布His+轉(zhuǎn)化子的G418平板老是不長(zhǎng)酵母而長(zhǎng)雜菌。另外還想問問是不是帶有his tag的蛋白酵母的表達(dá)量會(huì)降低？因?yàn)槲蚁胍帽容^高表達(dá)量的菌株對(duì)該蛋白進(jìn)行表征。有文獻(xiàn)建議His+轉(zhuǎn)化子不經(jīng)過G418篩選高拷貝而直接以深孔板培養(yǎng)篩選高表達(dá)量菌株，各位覺得哪種方法更靠譜呢？在同一個(gè)梯度的平板上，各菌株的表達(dá)量差異會(huì)否很大？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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4樓2015-10-05 12:29:11
duoyidian
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-10-07 22:53:31
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-10-07 22:53:31
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可以這樣篩選： 先用His缺陷型篩選，即MGY或者M(jìn)D培養(yǎng)級(jí)進(jìn)行初篩；等大概一天左右的時(shí)間，班上出現(xiàn)略微明顯的菌落之后，將菌落用2-3ml無菌水洗下來，富集菌體，測(cè)定菌濃OD600，0.04OD，0.12OD，0.2OD菌體（取大概50,150,250ul）進(jìn)行梯度篩選，G418的濃度分別對(duì)應(yīng)1,2,4mg/ml，涂板之后培養(yǎng)2-3天即可 |
6樓2015-10-05 18:53:14
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我們的做法是最高濃度板子上挑克隆。另外，96孔板固然方便，但是對(duì)于酵母菌，個(gè)人認(rèn)為不太好用，溶氧少，空間小，建議五十毫升錐形瓶，10～15毫升裝液量試試 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
17樓2015-10-08 07:55:11
★
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-10-07 22:53:11
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-10-07 22:53:11
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梯度加壓，增加zeocin濃度，篩選到2000的濃度，調(diào)取克隆進(jìn)行表達(dá)小試進(jìn)一步篩選。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，高濃度板子上長(zhǎng)出來的克隆表達(dá)量不見得高，曾有過不表達(dá)的情況。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-10-05 00:11:58
3樓2015-10-05 00:25:14
送紅花一朵 |
謝謝你，還想問問搖瓶是擋板瓶還是普通的呢？因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室搖床無法到300rpm，最多到200rpm，害怕溶氧不行。我想做小一點(diǎn)的，50ml一個(gè)。選幾個(gè)比較合適��？因?yàn)槲易罡邼舛鹊钠桨迳弦灿薪咏?0個(gè)�？偛荒芏继舭�。。。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2015-10-05 12:36:22
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謝謝你的回復(fù)，我看說明書說是富集菌體以無菌水稀釋至OD600=0.002（10^5個(gè)細(xì)胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想問問平板里除了G418能不能加入氨芐？另外你的方法為什么涂布OD這么高��？我的MD平板上長(zhǎng)了接近上千個(gè)菌落，復(fù)篩是選取最高抗性濃度的平板上長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和搖瓶復(fù)篩嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2015-10-06 00:26:32
duoyidian
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-10-07 22:53:52
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-10-07 22:53:52
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1)你要篩選高拷貝菌株，由于高拷貝的概率問題，菌體量的增加是為了增加篩出高拷貝的概率，同時(shí)如果你的MD平板長(zhǎng)出太多的菌體的話，也是正常的，因此才需要用抗生素進(jìn)行第二次篩選。 2)添加氨芐為什么？沒見過這么做的。 3)正常的篩出的4mg/ml的G418的板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子的數(shù)目大概為10-20個(gè)左右。 4）復(fù)篩的不也見得是想拿那些最高抗性的平板菌落進(jìn)行驗(yàn)證，看你的目的了，是單純的找出最高產(chǎn)量菌株還是要做拷貝數(shù)與產(chǎn)量的關(guān)系，看個(gè)人計(jì)劃與老板的安排。 |
8樓2015-10-06 12:11:55
9樓2015-10-06 13:36:53
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10樓2015-10-07 10:47:53
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