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畢赤酵母高拷貝篩選 已有2人參與
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如題，本人新手，做蛋白分子改造的，之前將目的基因構(gòu)建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博萊霉素篩選高拷貝，濃度達到1ug/ml，菌落PCR后挑取陽性菌落搖瓶表達，結(jié)果表達量極低。現(xiàn)在改變策略構(gòu)建到pPIC9K上用G418篩選高拷貝，想問問各位達人G418能不能和氨芐同時使用，因為之前做的時候涂布His+轉(zhuǎn)化子的G418平板老是不長酵母而長雜菌。另外還想問問是不是帶有his tag的蛋白酵母的表達量會降低？因為我想要拿比較高表達量的菌株對該蛋白進行表征。有文獻建議His+轉(zhuǎn)化子不經(jīng)過G418篩選高拷貝而直接以深孔板培養(yǎng)篩選高表達量菌株，各位覺得哪種方法更靠譜呢？在同一個梯度的平板上，各菌株的表達量差異會否很大？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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 蛋白表達純化鑒定精華 |
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duoyidian
木蟲 (正式寫手)
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:52
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:52
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1)你要篩選高拷貝菌株，由于高拷貝的概率問題，菌體量的增加是為了增加篩出高拷貝的概率，同時如果你的MD平板長出太多的菌體的話，也是正常的，因此才需要用抗生素進行第二次篩選。 2)添加氨芐為什么？沒見過這么做的。 3)正常的篩出的4mg/ml的G418的板上長出的轉(zhuǎn)化子的數(shù)目大概為10-20個左右。 4）復篩的不也見得是想拿那些最高抗性的平板菌落進行驗證，看你的目的了，是單純的找出最高產(chǎn)量菌株還是要做拷貝數(shù)與產(chǎn)量的關(guān)系，看個人計劃與老板的安排。 |
8樓2015-10-06 12:11:55
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
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梯度加壓，增加zeocin濃度，篩選到2000的濃度，調(diào)取克隆進行表達小試進一步篩選。根據(jù)經(jīng)驗，高濃度板子上長出來的克隆表達量不見得高，曾有過不表達的情況。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-10-05 00:11:58
3樓2015-10-05 00:25:14
3976084924樓2015-10-05 12:29:11
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