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[求助]
畢赤酵母高拷貝篩選 已有2人參與
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如題，本人新手，做蛋白分子改造的，之前將目的基因構(gòu)建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博萊霉素篩選高拷貝，濃度達(dá)到1ug/ml，菌落PCR后挑取陽性菌落搖瓶表達(dá)，結(jié)果表達(dá)量極低。現(xiàn)在改變策略構(gòu)建到pPIC9K上用G418篩選高拷貝，想問問各位達(dá)人G418能不能和氨芐同時使用，因為之前做的時候涂布His+轉(zhuǎn)化子的G418平板老是不長酵母而長雜菌。另外還想問問是不是帶有his tag的蛋白酵母的表達(dá)量會降低？因為我想要拿比較高表達(dá)量的菌株對該蛋白進(jìn)行表征。有文獻(xiàn)建議His+轉(zhuǎn)化子不經(jīng)過G418篩選高拷貝而直接以深孔板培養(yǎng)篩選高表達(dá)量菌株，各位覺得哪種方法更靠譜呢？在同一個梯度的平板上，各菌株的表達(dá)量差異會否很大？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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謝謝你的回復(fù)，我看說明書說是富集菌體以無菌水稀釋至OD600=0.002（10^5個細(xì)胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想問問平板里除了G418能不能加入氨芐？另外你的方法為什么涂布OD這么高��？我的MD平板上長了接近上千個菌落，復(fù)篩是選取最高抗性濃度的平板上長的單菌落進(jìn)行PCR驗證和搖瓶復(fù)篩嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2015-10-06 00:26:32
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
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梯度加壓，增加zeocin濃度，篩選到2000的濃度，調(diào)取克隆進(jìn)行表達(dá)小試進(jìn)一步篩選。根據(jù)經(jīng)驗，高濃度板子上長出來的克隆表達(dá)量不見得高，曾有過不表達(dá)的情況。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-10-05 00:11:58
3樓2015-10-05 00:25:14
3976084924樓2015-10-05 12:29:11
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