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沨1101金蟲 (小有名氣)
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[求助]
剛剛接觸RNA干擾，但是不知道這個RNA序列怎么來，用什么軟件來做，怎么選擇等等問題。 已有3人參與
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剛剛接觸RNA干擾，看了一點文獻，但是文獻中并沒有提到這個RNA怎么來的？難道這個RNA要自己設計嗎？ 請問一下用什么軟件設計，又有什么要求之類的？ 急呀，求大神幫忙！ |
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5樓2015-10-18 00:09:29
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1998年，Fire等人發(fā)現正義RNA或反義RAN技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當他們將體外轉錄所得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現，基因抑制效應變得十分微弱，而經過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異阻斷相應基因的表達。他們稱這種現象為RNA干涉（RNA interference, RNAi)。 RNAi的作用機理為： 外源的或體內產生的長雙鏈RNA(long double stranded RNA,dsRNA)首先被Dicer酶降解為長21-23bp長度的小分子雙鏈RNA（稱為小干擾核酸，small interfering RNA,siRNA),這是一個依賴ATP的耗能過程。siRNA作為RNAi的中介分子，是一種具有3'兩個核苷酸TT突出末端的21～23bp大小的雙鏈核糖核酸，通過序列互補配對法則特異性降解目的基因。 然后，siRNA結合到核糖核酸酶復合物上形成RNA誘導的基因沉默復合體（RISC，RNA-induced silencing complex）。該復合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC�；罨腞ISC通過由siRNA決定的堿基互補配對原理定位到具有同源序列的基因轉錄體，并在距離siRNA 3’端12個堿基的位置切割mRNA, 最終導致基因沉默效應。 同時，RNAi過程中又有新的dsRNA分子合成,當siRNA反義鏈識別并結合靶mRNA后,siRNA反義鏈可作為引物,以靶mRNA為模板，在依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割產生新的siRNA,新siRNA再去識別新一組mRNA,又產生新的siRNA,經過若干次合成切割循環(huán),沉默信號就會不斷放大。正是這種稱為靶序列指導的擴增(target-directed amplification)機制賦予了RNAi的高效性和持久性。 由于RNAi能高校特異地阻斷基因的表達，有研究已構建能形成發(fā)夾結構RNA（hairpin RNA,hpRNA）的載體，用此載體裝載目的基因的正向片段和反向片段，通過農桿菌轉化植物，使其轉錄和加工出siRNA，引發(fā)相應的mRNA降解，為研究基因功能提供有效工具。 因此，dsRNA是RNAi載體上轉錄的pre-RNA，由于正向片段與反向片段互補所形成的發(fā)夾結構RNA。由于RNAi載體是環(huán)狀雙鏈DNA，一般目的基因的正向片段和反向片段的序列相同，只是插入載體的方向相反。 由于dsRNA被剪切產生的micRNA是依據堿基互補配對原則靶定mRNA，一般在目的基因的CDS上設計引物擴增98bp-853bp正向片段和反向片段，既可以是ORF，也可以是UTR。用cDNA做PCR模板，記得片段兩端加上酶切位點。 參考資料： 1. 植物RNA干涉載體的構建及其在水稻基因表達沉默中的應用 2. 蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾_dsRNAi_研究 3. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants 4. RNAi的作用機理與應用 |
2樓2015-10-13 19:30:19
沨1101
金蟲 (小有名氣)
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3樓2015-10-14 18:37:54
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1. 你們實驗室有RNAi載體骨架，也就是可以直接插入目的基因正向片段和反向片段的重組質粒嗎？我們需要依據RNAi載體骨架的酶切位點設計引物。比如，2樓的pHANNIBAL載體骨架，其正向片段插入位點為XhoI和KpnI，反向片段插入位點為ClaI和XbaI，這些位點序列需要加在相應引物的5‘端。 2. 你們RNAi實驗針對的目的基因是什么？這個目的基因的cDNA需要是已知的，只有部分cDNA序列也可以。我們就根據cDNA序列設計引物，擴增帶有相應酶切位點的正向片段和反向片段。比如，2樓文獻《蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾_dsRNAi_研究》中的目的基因——蘋果多酚氧化酶（apple polyphenol oxidase, APPO）基因。其cDNA序列可以從NCBI Genbank中搜索“apple polyphenol oxidase”查找http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/D87670.1 。 3. 首先，根據cDNA設計普通PCR引物，可以使用在線Primer3 http://primer3.ut.ee/。PCR產物可以98bp-853bp，但為了便于酶切和連接操作，我們以一般選擇500bp以上的。然后在引物的5'端加上相應的酶切位點和保護堿基即可。比如，2樓文獻《蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾_dsRNAi_研究》中擴增710bp的引物。當然，這710bp片段不是唯一的，可以是該cDNA上容易擴增的任意片段。 設計要求不高，只要能擴增出來即可。但即可酶切位點要相對應，確保插入載體的正向片段和反向片段的方向相反。 |
4樓2015-10-14 20:10:44
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