 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 5797 | 回復(fù): 13 | ||
沨1101金蟲 (小有名氣)
|
[求助]
剛剛接觸RNA干擾，但是不知道這個RNA序列怎么來，用什么軟件來做，怎么選擇等等問題。 已有3人參與
|
|
|
剛剛接觸RNA干擾，看了一點文獻(xiàn)，但是文獻(xiàn)中并沒有提到這個RNA怎么來的？難道這個RNA要自己設(shè)計嗎？ 請問一下用什么軟件設(shè)計，又有什么要求之類的？ 急呀，求大神幫忙！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有292人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
|
1998年，F(xiàn)ire等人發(fā)現(xiàn)正義RNA或反義RAN技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄所得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。他們稱這種現(xiàn)象為RNA干涉（RNA interference, RNAi)。 RNAi的作用機(jī)理為： 外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的長雙鏈RNA(long double stranded RNA,dsRNA)首先被Dicer酶降解為長21-23bp長度的小分子雙鏈RNA（稱為小干擾核酸，small interfering RNA,siRNA),這是一個依賴ATP的耗能過程。siRNA作為RNAi的中介分子，是一種具有3'兩個核苷酸TT突出末端的21～23bp大小的雙鏈核糖核酸，通過序列互補(bǔ)配對法則特異性降解目的基因。 然后，siRNA結(jié)合到核糖核酸酶復(fù)合物上形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RISC，RNA-induced silencing complex）。該復(fù)合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC�；罨腞ISC通過由siRNA決定的堿基互補(bǔ)配對原理定位到具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，并在距離siRNA 3’端12個堿基的位置切割mRNA, 最終導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)。 同時，RNAi過程中又有新的dsRNA分子合成,當(dāng)siRNA反義鏈識別并結(jié)合靶mRNA后,siRNA反義鏈可作為引物,以靶mRNA為模板，在依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割產(chǎn)生新的siRNA,新siRNA再去識別新一組mRNA,又產(chǎn)生新的siRNA,經(jīng)過若干次合成切割循環(huán),沉默信號就會不斷放大。正是這種稱為靶序列指導(dǎo)的擴(kuò)增(target-directed amplification)機(jī)制賦予了RNAi的高效性和持久性。 由于RNAi能高校特異地阻斷基因的表達(dá)，有研究已構(gòu)建能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（hairpin RNA,hpRNA）的載體，用此載體裝載目的基因的正向片段和反向片段，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，使其轉(zhuǎn)錄和加工出siRNA，引發(fā)相應(yīng)的mRNA降解，為研究基因功能提供有效工具。 因此，dsRNA是RNAi載體上轉(zhuǎn)錄的pre-RNA，由于正向片段與反向片段互補(bǔ)所形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA。由于RNAi載體是環(huán)狀雙鏈DNA，一般目的基因的正向片段和反向片段的序列相同，只是插入載體的方向相反。 由于dsRNA被剪切產(chǎn)生的micRNA是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則靶定mRNA，一般在目的基因的CDS上設(shè)計引物擴(kuò)增98bp-853bp正向片段和反向片段，既可以是ORF，也可以是UTR。用cDNA做PCR模板，記得片段兩端加上酶切位點。 參考資料： 1. 植物RNA干涉載體的構(gòu)建及其在水稻基因表達(dá)沉默中的應(yīng)用 2. 蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾_dsRNAi_研究 3. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants 4. RNAi的作用機(jī)理與應(yīng)用 |
2樓2015-10-13 19:30:19
|
1. 你們實驗室有RNAi載體骨架，也就是可以直接插入目的基因正向片段和反向片段的重組質(zhì)粒嗎？我們需要依據(jù)RNAi載體骨架的酶切位點設(shè)計引物。比如，2樓的pHANNIBAL載體骨架，其正向片段插入位點為XhoI和KpnI，反向片段插入位點為ClaI和XbaI，這些位點序列需要加在相應(yīng)引物的5‘端。 2. 你們RNAi實驗針對的目的基因是什么？這個目的基因的cDNA需要是已知的，只有部分cDNA序列也可以。我們就根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物，擴(kuò)增帶有相應(yīng)酶切位點的正向片段和反向片段。比如，2樓文獻(xiàn)《蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾_dsRNAi_研究》中的目的基因——蘋果多酚氧化酶（apple polyphenol oxidase, APPO）基因。其cDNA序列可以從NCBI Genbank中搜索“apple polyphenol oxidase”查找http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/D87670.1 。 3. 首先，根據(jù)cDNA設(shè)計普通PCR引物，可以使用在線Primer3 http://primer3.ut.ee/。PCR產(chǎn)物可以98bp-853bp，但為了便于酶切和連接操作，我們以一般選擇500bp以上的。然后在引物的5'端加上相應(yīng)的酶切位點和保護(hù)堿基即可。比如，2樓文獻(xiàn)《蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾_dsRNAi_研究》中擴(kuò)增710bp的引物。當(dāng)然，這710bp片段不是唯一的，可以是該cDNA上容易擴(kuò)增的任意片段。 設(shè)計要求不高，只要能擴(kuò)增出來即可。但即可酶切位點要相對應(yīng)，確保插入載體的正向片段和反向片段的方向相反。 |
4樓2015-10-14 20:10:44
沨1101
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 1034.1
- 散金: 42
- 紅花: 2
- 帖子: 142
- 在線: 21.1小時
- 蟲號: 3449232
- 注冊: 2014-09-29
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
3樓2015-10-14 18:37:54
5樓2015-10-18 00:09:29
董博士
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 155 (高中生)
- 金幣: 3129.9
- 紅花: 24
- 帖子: 312
- 在線: 96.2小時
- 蟲號: 3524307
- 注冊: 2014-11-07
- 專業(yè): 醫(yī)學(xué)圖像數(shù)據(jù)處理與分析
6樓2015-10-18 18:05:38
董博士
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 155 (高中生)
- 金幣: 3129.9
- 紅花: 24
- 帖子: 312
- 在線: 96.2小時
- 蟲號: 3524307
- 注冊: 2014-11-07
- 專業(yè): 醫(yī)學(xué)圖像數(shù)據(jù)處理與分析
7樓2015-10-18 18:08:03
Neo2000
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 639 (博士)
- 金幣: 8720.2
- 紅花: 37
- 帖子: 1700
- 在線: 269.3小時
- 蟲號: 322365
- 注冊: 2007-03-11
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
8樓2015-10-18 19:37:20
沨1101
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 1034.1
- 散金: 42
- 紅花: 2
- 帖子: 142
- 在線: 21.1小時
- 蟲號: 3449232
- 注冊: 2014-09-29
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
9樓2015-10-20 10:16:34
徘徊云中
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 977.4
- 散金: 20
- 帖子: 70
- 在線: 49小時
- 蟲號: 2763636
- 注冊: 2013-10-29
- 性別: GG
- 專業(yè): 有機(jī)化學(xué)
10樓2015-12-24 21:11:09
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 沨1101 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 本科鄭州大學(xué)物理學(xué)院，一志愿華科070200學(xué)碩，346求調(diào)劑 +3 | 我不是一根蔥 2026-03-18 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 328求調(diào)劑，英語六級551，有科研經(jīng)歷 +3 | 生物工程調(diào)劑 2026-03-16 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 26調(diào)劑/材料/英一數(shù)二/總分289/已過A區(qū)線 +7 | 步川酷紫123 2026-03-13 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0817 化學(xué)工程 299分求調(diào)劑 有科研經(jīng)歷 有二區(qū)文章 +7 | rare12345 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研]
 0854，計算機(jī)類招收調(diào)劑
+3
|
胡辣湯放糖 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 工科材料085601 279求調(diào)劑 +6 | 困于星晨 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +9 | yy要上岸呀 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 考研求調(diào)劑 +3 | 橘頌. 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +4 | A_JiXing 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[論文投稿] 有沒有大佬發(fā)小論文能帶我個二作 +3 | 增銳漏人 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 機(jī)械專碩325，尋找調(diào)劑院校 +3 | y9999 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070300化學(xué)學(xué)碩求調(diào)劑 +6 | 太想進(jìn)步了0608 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求老師收留調(diào)劑 +4 | jiang姜66 2026-03-14 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 中科大材料專碩319求調(diào)劑 +3 | 孟鑫材料 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 學(xué)碩285求調(diào)劑 +13 | Wisjxn 2026-03-12 | 46/2300 |
|
|
|
[考研] 330求調(diào)劑 +3 | ?醬給調(diào)劑跪了 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工（0856）304求B區(qū)調(diào)劑 +6 | 邱gl 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] ［0860］321分求調(diào)劑，ab區(qū)皆可 +4 | 寶貴熱 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +7 | 綠豆芹菜湯 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 152697 2026-03-12 | 4/200 |
|