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擬南芥根的半薄切片 已有2人參與
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做了幾次半薄切片，細(xì)胞變形，并且有的破碎了。步驟如下，請(qǐng)問(wèn)問(wèn)題出現(xiàn)在哪里？謝謝 一、第一次固定 固定液：2%戊二醛溶液 +4%多聚甲醛 in 25mM CaCo buffer pH 7.2（最關(guān)健步驟） 室溫15 min，固定時(shí)，應(yīng)讓材料沉底。 4度過(guò)夜 二、清洗 用25 mM CaCo buffer清洗4次，每次10min。 三、清洗 用水洗4次，每次10分鐘（務(wù)必洗干凈）。 四、梯度脫水 Dehydrate the samples by the following steps: 25% 丙酮 at RT for 30 min (x 1) 50%丙酮 at RT for 30 min (x 1) 75%丙酮 at RT for 30 min (x 1) 100%丙酮 at RT for 30 min (x 2) 五、滲透 Change the Spurr in the following steps: 25% Spurr in acetone at RT for 45 min 50% Spurr in acetone at RT for 45 min 75% Spurr in acetone at RT for 45 min 100% Spurr in acetone at RT for 45 min 100% Spurr in acetone overnight at 4oC 八、包埋 Change 100% Spurr in acetone once more, and then put the samples into beemcapsules and then incubate at RT for 4 h. Then imbedding the beemcapsules for 16 hours at 70 度。 九、切片 玻璃刀切 十、復(fù)染 亞甲基藍(lán)染色,洗脫三次 CaCO Buffer配方： 包埋劑的配比：10 g VCD(ERL), 6 g DER, 26 g NSA，輕輕攪拌至均勻，加0.4 g DMAE，再次攪拌均勻。（注意防水，不宜長(zhǎng)期存放） |
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【答案】應(yīng)助回帖
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切破最直接的原因是有水，說(shuō)明脫水不干凈，建議增加丙酮梯度脫水為30，50，75，85，90，95，100，100，同時(shí)所有步驟進(jìn)行時(shí)，盡量在有抽濕機(jī)環(huán)境下，濕度低于30%。另外，spurr切片不應(yīng)該有一步鋨酸固定嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
2樓2015-10-29 19:58:45
送紅花一朵 |
我其實(shí)是做半薄切片，沒(méi)用電鏡看超微結(jié)構(gòu)，我還有一個(gè)問(wèn)題就是細(xì)胞變形，這也跟脫水梯度和時(shí)間有關(guān)系嗎？我有一個(gè)染gus的幼苗，因?yàn)橐?0%的乙醇洗脫葉綠素，所以我想用FAA固定，然后用乙醇脫水，再用spur可以嗎？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2015-10-30 00:06:51
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1.我們無(wú)論是半薄還是超薄，都需要鋨酸固定，戊二醛至多算是預(yù)固定 2.細(xì)胞變形的原因比破裂復(fù)雜，無(wú)鋨酸，脫水太快，刀口鋒利程度，等等，都需要注意 3.理論上說(shuō)，只要能與spurr和水互溶的試劑均可以用來(lái)脫水，但需要考慮乙醇的脫水效果不如丙酮 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-10-30 06:01:02
champion555 
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- 專業(yè): 細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能
5樓2015-10-30 08:28:38
【答案】應(yīng)助回帖
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一般做擬南芥根形態(tài)學(xué)觀察遇到的問(wèn)題都是細(xì)胞收縮。樓主遇到細(xì)胞破碎的問(wèn)題我個(gè)人觀點(diǎn)可能有兩個(gè)原因。 1.漂洗脫水等條件不恰當(dāng)，就象前面有蟲友說(shuō)脫水梯度安排的過(guò)大不夠溫和是一方面，我想更主要的是漂洗緩沖液滲透壓過(guò)低，造成細(xì)胞在漂洗時(shí)不停從環(huán)境中吸水而漲破了。一般動(dòng)物樣品用生理鹽水濃度 90mM，根遇到的環(huán)境含水更多因此滲透壓還要再低一些60-80mM。 2.樣品取材太大，固定劑滲透不完全，造成樣品塊中間的細(xì)胞固定不完全，也會(huì)導(dǎo)致切片破碎的。 樓主可以用關(guān)鍵詞“同濟(jì)大學(xué)，祝建，擬南芥根”搜索，祝老師團(tuán)隊(duì)是國(guó)內(nèi)利用顯微鏡研究擬南芥根的權(quán)威之一，他們的protocol應(yīng)該比較有參考價(jià)值 |
6樓2015-10-30 14:41:13
7樓2015-10-30 14:44:17
8樓2015-10-30 17:01:42
9樓2015-10-30 17:02:53
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