 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 動植物 » 實驗技術 » 擬南芥根的半薄切片
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1991 | 回復: 8 | ||
[求助]
擬南芥根的半薄切片 已有2人參與
|
|
做了幾次半薄切片，細胞變形，并且有的破碎了。步驟如下，請問問題出現(xiàn)在哪里？謝謝 一、第一次固定 固定液：2%戊二醛溶液 +4%多聚甲醛 in 25mM CaCo buffer pH 7.2（最關健步驟） 室溫15 min，固定時，應讓材料沉底。 4度過夜 二、清洗 用25 mM CaCo buffer清洗4次，每次10min。 三、清洗 用水洗4次，每次10分鐘（務必洗干凈）。 四、梯度脫水 Dehydrate the samples by the following steps: 25% 丙酮 at RT for 30 min (x 1) 50%丙酮 at RT for 30 min (x 1) 75%丙酮 at RT for 30 min (x 1) 100%丙酮 at RT for 30 min (x 2) 五、滲透 Change the Spurr in the following steps: 25% Spurr in acetone at RT for 45 min 50% Spurr in acetone at RT for 45 min 75% Spurr in acetone at RT for 45 min 100% Spurr in acetone at RT for 45 min 100% Spurr in acetone overnight at 4oC 八、包埋 Change 100% Spurr in acetone once more, and then put the samples into beemcapsules and then incubate at RT for 4 h. Then imbedding the beemcapsules for 16 hours at 70 度。 九、切片 玻璃刀切 十、復染 亞甲基藍染色,洗脫三次 CaCO Buffer配方： 包埋劑的配比：10 g VCD(ERL), 6 g DER, 26 g NSA，輕輕攪拌至均勻，加0.4 g DMAE，再次攪拌均勻。（注意防水，不宜長期存放） |
回復此樓» 猜你喜歡
江蘇省優(yōu)青門檻
已經(jīng)有20人回復
-
心好累。今年我們部門提交了18個項目。中了11了，可惜我的又掛了
已經(jīng)有10人回復
-
植物學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有166人回復
-
面上項目計劃書
已經(jīng)有7人回復
-
面上項目計劃書附件
已經(jīng)有9人回復
-
面上項目計劃書系統(tǒng)狀態(tài)
已經(jīng)有18人回復
-
NSFC-UNEP（與聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署）合作項目
已經(jīng)有33人回復
-
和伊朗人合作
已經(jīng)有32人回復
-
江蘇省自然基金
已經(jīng)有7人回復
-
生命科學新英文普刊《INVESTIGATION OF LIFE SCIENCE》
已經(jīng)有4人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
【答案】應助回帖
|
切破最直接的原因是有水，說明脫水不干凈，建議增加丙酮梯度脫水為30，50，75，85，90，95，100，100，同時所有步驟進行時，盡量在有抽濕機環(huán)境下，濕度低于30%。另外，spurr切片不應該有一步鋨酸固定嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-10-29 19:58:45
送紅花一朵 |
我其實是做半薄切片，沒用電鏡看超微結(jié)構(gòu)，我還有一個問題就是細胞變形，這也跟脫水梯度和時間有關系嗎？我有一個染gus的幼苗，因為要用70%的乙醇洗脫葉綠素，所以我想用FAA固定，然后用乙醇脫水，再用spur可以嗎？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2015-10-30 00:06:51
|
1.我們無論是半薄還是超薄，都需要鋨酸固定，戊二醛至多算是預固定 2.細胞變形的原因比破裂復雜，無鋨酸，脫水太快，刀口鋒利程度，等等，都需要注意 3.理論上說，只要能與spurr和水互溶的試劑均可以用來脫水，但需要考慮乙醇的脫水效果不如丙酮 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-10-30 06:01:02
champion555 
捐助貴賓 (正式寫手)
- 應助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 1746.4
- 散金: 320
- 紅花: 3
- 帖子: 333
- 在線: 104.3小時
- 蟲號: 978605
- 注冊: 2010-03-22
- 性別: GG
- 專業(yè): 細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)與功能
5樓2015-10-30 08:28:38
【答案】應助回帖
|
一般做擬南芥根形態(tài)學觀察遇到的問題都是細胞收縮。樓主遇到細胞破碎的問題我個人觀點可能有兩個原因。 1.漂洗脫水等條件不恰當，就象前面有蟲友說脫水梯度安排的過大不夠溫和是一方面，我想更主要的是漂洗緩沖液滲透壓過低，造成細胞在漂洗時不停從環(huán)境中吸水而漲破了。一般動物樣品用生理鹽水濃度 90mM，根遇到的環(huán)境含水更多因此滲透壓還要再低一些60-80mM。 2.樣品取材太大，固定劑滲透不完全，造成樣品塊中間的細胞固定不完全，也會導致切片破碎的。 樓主可以用關鍵詞“同濟大學，祝建，擬南芥根”搜索，祝老師團隊是國內(nèi)利用顯微鏡研究擬南芥根的權威之一，他們的protocol應該比較有參考價值 |
6樓2015-10-30 14:41:13
7樓2015-10-30 14:44:17
8樓2015-10-30 17:01:42
9樓2015-10-30 17:02:53
相關版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 秉秉的法蘭西 的主題更新
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿211 初試270分 求調(diào)劑 +3 | 谷雨上岸 2026-03-23 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿上海交大生物與醫(yī)藥專碩324分，求調(diào)劑 +4 | jiajunX 2026-03-22 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 工科0856求調(diào)劑 +4 | 沐析汀汀 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 336化工調(diào)劑 +3 | 王大坦1 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿211 +3 | 上岸6666@ 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +4 | plum李子 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +7 | Auroracx 2026-03-22 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 生物學一志愿985，分數(shù)349求調(diào)劑 +4 | zxts12 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 280求調(diào)劑 +11 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 廣西大學材料導師推薦 +3 | 夏夏夏小正 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 化學調(diào)劑 +5 | yzysaa 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070300化學319求調(diào)劑 +7 | 錦鯉0909 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 睿08 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +6 | △小透明* 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿中國石油大學（華東） 本科齊魯工業(yè)大學 +3 | 石能偉 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 330求調(diào)劑 +4 | 小材化本科 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +16 | 于海海海海 2026-03-19 | 16/800 |
|
|
|
[考研]
 材料與化工 322求調(diào)劑
+4
|
然11 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[碩博家園] 湖北工業(yè)大學 生命科學與健康學院-課題組招收2026級食品/生物方向碩士 +3 | 1喜春8 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[論文投稿] 有沒有大佬發(fā)小論文能帶我個二作 +3 | 增銳漏人 2026-03-17 | 4/200 |
|