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肉肉肉.鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
關(guān)于酵母表達(dá)真菌蛋白的一些困惑！ 已有1人參與
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各位大神好！本人最近在用ppic9k酵母表達(dá)載體表達(dá)一個(gè)真菌里面的蛋白。測(cè)序結(jié)果已經(jīng)顯示我想要的蛋白序列已經(jīng)成功連入了載體上，用MD平板也篩選到了his+的轉(zhuǎn)化子，但是進(jìn)行誘導(dǎo)后用鎳柱純化蛋白卻沒有得到我的目的蛋白，看來是沒有成功表達(dá)！很是煩惱！現(xiàn)在懷疑是不是9k載體上面的AOX1啟動(dòng)子被破壞了，所以設(shè)計(jì)了引物去測(cè)序，但是結(jié)果還沒有出來！很著急！然后看了篇文獻(xiàn)上面寫到作者在表達(dá)蛋白的時(shí)候去除了內(nèi)含子以及信號(hào)肽序列，我之前表達(dá)的時(shí)候先去ncbi找到目的蛋白的cds序列，然后去除了信號(hào)肽，提RNA后擴(kuò)增出不包含信號(hào)肽的目的序列。然后進(jìn)行后續(xù)操作。請(qǐng)問各位大神，是不是由于沒有考慮去除內(nèi)含子的原因，所以我的目的蛋白才沒有表達(dá)出來？跪謝��！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
肉肉肉.: 金幣+10 2015-11-13 18:55:16
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
肉肉肉.: 金幣+10 2015-11-13 18:55:16
| 我感覺更像是誘導(dǎo)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，就是說不是載體的問題，而是就沒表達(dá)出想要的蛋白質(zhì)。關(guān)于酵母誘導(dǎo)方式，最好在查詢相關(guān)文獻(xiàn)。其次就是跨物種表達(dá)蛋白質(zhì)，應(yīng)該是都要求去掉內(nèi)含子的，畢竟不同物種內(nèi)含子的剪切方式不同，就算是成功表達(dá)也不一定就是所需要的蛋白質(zhì)。 |
4樓2015-11-13 18:52:36
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2樓2015-11-13 17:32:17
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謝謝謝謝！我按照誘導(dǎo)手冊(cè)來誘導(dǎo)的，也誘導(dǎo)了兩遍，都沒成功。還有就是，請(qǐng)為你知道如何去除內(nèi)含子嗎？因?yàn)槲揖椭苯訌膎cbi上面找到了該蛋白的cds編碼區(qū)，里面也沒有說明哪些是內(nèi)含子，不知道有沒有什么工具或者方法可以去除內(nèi)含子？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2015-11-13 18:57:52
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6樓2015-11-14 19:40:58
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