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肉肉肉.鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
關(guān)于酵母表達(dá)真菌蛋白的一些困惑！ 已有1人參與
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各位大神好！本人最近在用ppic9k酵母表達(dá)載體表達(dá)一個(gè)真菌里面的蛋白。測(cè)序結(jié)果已經(jīng)顯示我想要的蛋白序列已經(jīng)成功連入了載體上，用MD平板也篩選到了his+的轉(zhuǎn)化子，但是進(jìn)行誘導(dǎo)后用鎳柱純化蛋白卻沒(méi)有得到我的目的蛋白，看來(lái)是沒(méi)有成功表達(dá)！很是煩惱！現(xiàn)在懷疑是不是9k載體上面的AOX1啟動(dòng)子被破壞了，所以設(shè)計(jì)了引物去測(cè)序，但是結(jié)果還沒(méi)有出來(lái)！很著急！然后看了篇文獻(xiàn)上面寫(xiě)到作者在表達(dá)蛋白的時(shí)候去除了內(nèi)含子以及信號(hào)肽序列，我之前表達(dá)的時(shí)候先去ncbi找到目的蛋白的cds序列，然后去除了信號(hào)肽，提RNA后擴(kuò)增出不包含信號(hào)肽的目的序列。然后進(jìn)行后續(xù)操作。請(qǐng)問(wèn)各位大神，是不是由于沒(méi)有考慮去除內(nèi)含子的原因，所以我的目的蛋白才沒(méi)有表達(dá)出來(lái)？跪謝！！ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
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肉肉肉.: 金幣+10 2015-11-16 12:15:57
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
肉肉肉.: 金幣+10 2015-11-16 12:15:57
| 在酵母內(nèi)表達(dá)其它物種的蛋白是要去內(nèi)含子的cDNA, 酵母不能正確去除其它生物的內(nèi)含子。NCBI查詢應(yīng)該可以看到許多同源的基因做參考確定是否為CDNA，若本身表明是CDS，說(shuō)明是去除內(nèi)含子的，或者基因本身就沒(méi)有內(nèi)含子，是特例了。我在做過(guò)柱前都要做WESTERN檢測(cè)的，可以看到你目標(biāo)蛋白的大小，表達(dá)量等，也可以看出誘導(dǎo)效果如何，而不僅僅是看是否菌落長(zhǎng)了。順祝實(shí)驗(yàn)順利！ |
8樓2015-11-15 00:01:50
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2樓2015-11-13 17:32:17
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3樓2015-11-13 18:06:47
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肉肉肉.: 金幣+10 2015-11-13 18:55:16
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肉肉肉.: 金幣+10 2015-11-13 18:55:16
| 我感覺(jué)更像是誘導(dǎo)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，就是說(shuō)不是載體的問(wèn)題，而是就沒(méi)表達(dá)出想要的蛋白質(zhì)。關(guān)于酵母誘導(dǎo)方式，最好在查詢相關(guān)文獻(xiàn)。其次就是跨物種表達(dá)蛋白質(zhì)，應(yīng)該是都要求去掉內(nèi)含子的，畢竟不同物種內(nèi)含子的剪切方式不同，就算是成功表達(dá)也不一定就是所需要的蛋白質(zhì)。 |
4樓2015-11-13 18:52:36
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謝謝謝謝！我按照誘導(dǎo)手冊(cè)來(lái)誘導(dǎo)的，也誘導(dǎo)了兩遍，都沒(méi)成功。還有就是，請(qǐng)為你知道如何去除內(nèi)含子嗎？因?yàn)槲揖椭苯訌膎cbi上面找到了該蛋白的cds編碼區(qū)，里面也沒(méi)有說(shuō)明哪些是內(nèi)含子，不知道有沒(méi)有什么工具或者方法可以去除內(nèi)含子？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
5樓2015-11-13 18:57:52
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6樓2015-11-14 19:40:58
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7樓2015-11-14 21:06:42
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
肉肉肉.: 金幣+5, 謝謝謝謝 2015-11-16 12:16:45
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
肉肉肉.: 金幣+5, 謝謝謝謝 2015-11-16 12:16:45
| 樓主先查一下這個(gè)基因的基因組序列，可能你的基因里面根本沒(méi)有內(nèi)含子，比如釀酒酵母基因組中只有4%的編碼基因含有小的內(nèi)含子。如果有一般酵母蛋白表達(dá)都是用RT-PCR或overlap PCR等方法去除內(nèi)含子獲得cDNA，然后再做相應(yīng)的表達(dá)。 |
9樓2015-11-16 09:21:16
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在ncbi里面我選的cds區(qū)域，就是編碼區(qū)。根據(jù)這個(gè)克隆然后表達(dá)。用的9K質(zhì)粒。但是轉(zhuǎn)化到酵母gs115里面之后提取酵母組基因，照理說(shuō)用AOX1通用引物應(yīng)該有兩條條帶，但是只有一條。難道gs115里面的AOX1基因組壞了？還有就是我誘導(dǎo)的時(shí)候發(fā)酵液好臭，難道染菌了？可以通過(guò)加抗生素amp之類(lèi)的誘導(dǎo)嗎？做WB也沒(méi)有，看來(lái)是沒(méi)表達(dá)出來(lái)，但是測(cè)序結(jié)果都顯示正確！不知道為啥，難道要重新做嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
10樓2015-11-16 12:15:27
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