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[交流]
測定NADPH依賴的酶活性的詭異現(xiàn)象，求解釋
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測定原核表達(dá)，鎳柱純化得到的一個NADPH依賴的還原酶，在測定這個酶的活性的時候發(fā)現(xiàn)一個問題： 體系1：正常的反應(yīng)體系，加入了酶，NADPH，底物，緩沖體系PH=6.0正常反應(yīng) 體系2：對照組，加入煮死的酶，NADPH，底物，緩沖體系PH=6.0 體系3：加入了酶，NADPH，底物，緩沖體系PH=6.0，這一體系里不加底物 在333nm下測定反應(yīng)30min的情況，結(jié)果很讓人費(fèi)解： 我們發(fā)現(xiàn)，正常反應(yīng)體系反應(yīng)催化底物減少的ABS值沒有沒加底物的體系3降低得多，換句話說，即使不加底物，單純的酶與NADPH也可以一直反應(yīng)并出現(xiàn) ABS的持續(xù)下降？？ 自己排查了一些因素于是做了一些對照試驗：1，體系2中煮死的酶的情況下是沒有這一現(xiàn)象的，雖然消光系數(shù)有上下波動，但是是在可以接受的范圍內(nèi)。 2， 換用本實(shí)驗室同種方法純化的另一個酶（這個酶是裂解酶，沒有還原活性，也不是NADPH依賴的），配置 體系3，測定結(jié)果和對照組類似（體系2的結(jié)果，也即是煮死酶的情況） 這樣看來似乎可以排除是體系中其他溶液的問題，或者蛋白純化過程引進(jìn)的物質(zhì)的影響，可是對于這一還原酶體系3里的情況該怎么解釋，難道可以單純的催化NADPH？ 求各位前輩各位大俠指教，謝謝啦 |
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7樓2015-11-16 11:54:55
★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
策馬入林: 金幣+2, 多謝一直以來的交流學(xué)習(xí) 2015-11-16 16:40:30
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
策馬入林: 金幣+2, 多謝一直以來的交流學(xué)習(xí) 2015-11-16 16:40:30
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溶液是否澄清，油水是否乳化，靜止?fàn)顟B(tài)，OD會變化 如果你這邊驗證體系無影響，那回到剛才的猜想：有的溶劑也會與酶反應(yīng)，做為底物。 輔酶NADPH循環(huán)再生也是酶催化反應(yīng)，正常酶催化反應(yīng)，是兩個酶偶聯(lián)，但是這兩個體系可以看作是獨(dú)立的兩個酶催化反應(yīng)，所以沒有你說的目標(biāo)產(chǎn)物的底物，并不代表沒有酶能夠催化的底物，  我很好奇這個酶哦，還是有可能是將溶劑作為底物了 |
8樓2015-11-16 13:49:51
9樓2015-11-16 16:40:04
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