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測定NADPH依賴的酶活性的詭異現(xiàn)象,求解釋
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測定原核表達,鎳柱純化得到的一個NADPH依賴的還原酶,在測定這個酶的活性的時候發(fā)現(xiàn)一個問題: 體系1:正常的反應(yīng)體系,加入了酶,NADPH,底物,緩沖體系PH=6.0正常反應(yīng) 體系2:對照組,加入煮死的酶,NADPH,底物,緩沖體系PH=6.0 體系3:加入了酶,NADPH,底物,緩沖體系PH=6.0,這一體系里不加底物 在333nm下測定反應(yīng)30min的情況,結(jié)果很讓人費解: 我們發(fā)現(xiàn),正常反應(yīng)體系反應(yīng)催化底物減少的ABS值沒有沒加底物的體系3降低得多,換句話說,即使不加底物,單純的酶與NADPH也可以一直反應(yīng)并出現(xiàn) ABS的持續(xù)下降?? 自己排查了一些因素于是做了一些對照試驗:1,體系2中煮死的酶的情況下是沒有這一現(xiàn)象的,雖然消光系數(shù)有上下波動,但是是在可以接受的范圍內(nèi)。 2, 換用本實驗室同種方法純化的另一個酶(這個酶是裂解酶,沒有還原活性,也不是NADPH依賴的),配置 體系3,測定結(jié)果和對照組類似(體系2的結(jié)果,也即是煮死酶的情況) 這樣看來似乎可以排除是體系中其他溶液的問題,或者蛋白純化過程引進的物質(zhì)的影響,可是對于這一還原酶體系3里的情況該怎么解釋,難道可以單純的催化NADPH? 求各位前輩各位大俠指教,謝謝啦 |
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