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HPLC純化蛋白質(zhì) 已有8人參與
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已經(jīng)記不得課堂上關(guān)于HPLC的知識(shí)是哪位老師講的了，或許那時(shí)她給講睡著了，所以，錯(cuò)過(guò)的知識(shí)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)課堂上被屏蔽的信號(hào)，總是一片空白。 然而，重新走進(jìn)HPLC，連不上記憶，更談不上溫故而知新，只得重新查找各種資料，本文詳細(xì)的簡(jiǎn)述了HPLC的定義、分離模式、種類，供沒(méi)有背景知識(shí)的讀者參考。 我相信，離開課堂的你，總會(huì)和我一樣，慢慢地找到未來(lái)自己想要抓住的知識(shí)，并細(xì)細(xì)鉆研。 ——可以重拾課堂上的知識(shí)，只是時(shí)光再也回不去 色譜法最早應(yīng)用于植物色素的分離，1906年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特用碳酸鈣作為固定相填充豎立的玻璃管，植物色素的提取液流經(jīng)固定相，經(jīng)過(guò)石油醚進(jìn)行洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中由一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶，色譜法(Chromatography)因之得名。 經(jīng)典的液相色譜法開始階段是在室溫和常壓下，在大直徑的玻璃管柱內(nèi)利用液位差輸送流動(dòng)相，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是固定相填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，以高壓驅(qū)動(dòng)輸送流動(dòng)相，分離工作在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)，又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。 高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)利用不同蛋白質(zhì)的分子量大小、形狀、帶電荷性質(zhì)、疏水性、親和性不同來(lái)分離檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)。溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（配基親和性吸附、不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配、離子間吸引作用、分子量排阻）的大小、強(qiáng)弱不同，以不同的速度流經(jīng)固定相，最終達(dá)到分離蛋白的作用，又稱為色層法、層析法。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。 HPLC由液體輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱和檢測(cè)系統(tǒng)4部分所組成。 輸液泵將流動(dòng)相樣品以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，通過(guò)進(jìn)樣品導(dǎo)入色譜柱，在色譜柱中各組分依照分配系數(shù)、吸附力大小、帶電性質(zhì)、疏水性、親和性以及蛋白質(zhì)的分子量大小的差異而被分離，并依次隨流動(dòng)相流至檢測(cè)器，將檢測(cè)到的信號(hào)送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)記錄、處理或保存，目前HPLC技術(shù)廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離和檢測(cè)。根據(jù)蛋白質(zhì)在物理、化學(xué)及功能上的差異選擇不同的HPLC分離模式來(lái)分離目標(biāo)蛋白，常見的分離模式有： 反相高效液相色譜 （reversephasehigh-perfor-manceliquidchromatography，RP—HPLC） 在HPLC 各種模式中，RP - HPLC 應(yīng)用最為廣泛。蛋白質(zhì)分子混合物在RP – HPLC模式系統(tǒng)中因其極性的差異而分離，且蛋白質(zhì)分子因其疏水性的不同在兩相中的分配也不同。一般其固定相是非極性的（如C18、C8），而流動(dòng)相是比固定相極性更強(qiáng)的溶劑系統(tǒng)，流動(dòng)相一般為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。 當(dāng)使用RP-HPLC進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，一般需要低pH 值流動(dòng)相，室溫或較高的溫度及使用乙腈或異丙醇作為有機(jī)部分，另外，三氟乙酸( TFA)是反相色譜中最常用的離子對(duì)試劑。常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常具有強(qiáng)極性，所以蛋白質(zhì)的保留性質(zhì)和選擇性還與鍵合固定相的性質(zhì)有關(guān)，蛋白質(zhì)與C18的結(jié)合較困難，實(shí)驗(yàn)表明，大孔硅膠(20～30 nm) 短鏈烷基(C4 和C8) 鍵合固定相適合蛋白質(zhì)的分離。 高效親和色譜 （highperformanceaffinitychro-matography，HPAFC） 蛋白質(zhì)與層析載體上固相化的配體之間通過(guò)共價(jià)鍵、范德華力、疏水力、靜電力等作用發(fā)生生物學(xué)專一性結(jié)合，鏈接在載體表面的功能團(tuán)配體上，能與特異性蛋白質(zhì)大分子發(fā)生親和作用的基團(tuán)如酶的作用底物，輔酶，激素受體，抗原與抗體的結(jié)合，這種高度專一性結(jié)合特性可用于親和色譜分離。HPAFC 是蛋白質(zhì)檢測(cè)中最專一的分離技術(shù),可以從復(fù)雜的混合物中直接分離到目標(biāo)蛋白質(zhì)，特別適合疫苗、糖蛋白和抗體等的分離純化 高效離子交換色譜 （highperformanceionex-changechromatography，HPIEC） HPIEC是以離子交換劑為固定相，常見的離子交換劑是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)共價(jià)結(jié)合某種電荷基團(tuán)，形成帶基質(zhì)，平衡離子可以通過(guò)靜電力作用結(jié)合在電荷基質(zhì)上，樣品流動(dòng)相中的離子可與平衡離子進(jìn)行可逆交換而吸附在電荷基質(zhì)上。離子交換色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)分子在一定的pH 和離子強(qiáng)度條件下所帶電荷和固定相上的離子間結(jié)合力的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。近幾年來(lái)HPIEC 也成為分離檢測(cè)蛋白質(zhì)的重要方法。 高效凝膠過(guò)濾色譜 （highperformancesizeexclu-sionchromatography，HPSEC） 凝膠過(guò)濾色譜也稱體積排阻色譜(Size exclusion chromatography ,SEC) , 是根據(jù)蛋白相對(duì)分子大小進(jìn)行分離的一種色譜技術(shù)。固定相具有分子篩的作用，流動(dòng)相為樣品溶液，當(dāng)不同分子大小的樣品同時(shí)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比孔穴孔徑大的分子不能進(jìn)入到凝膠孔內(nèi)部，被排阻在孔外，隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，最先流出柱子；而較小的分子滲透進(jìn)入凝膠孔內(nèi)部，流動(dòng)速度慢，路程長(zhǎng)，最后流出；而分子大小介于兩者之間的樣品在流動(dòng)中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，流出時(shí)間介于兩者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。相對(duì)于吸附性液相色譜技術(shù)而言，SEC 的分辨力和上樣體積都有限。 知識(shí)天空 知識(shí)的確是天空中偉大的太陽(yáng),它那萬(wàn)道光芒投下了生命,投下了力量 ——-丹•伯斯特 最熟悉的培根名言，知識(shí)就是力量，期待每個(gè)人都能抓住自己想要鉆研的知識(shí)，轉(zhuǎn)化為獨(dú)特的力量。 |
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2015-11-26 08:58:19, 140.88 K
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