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RT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR詳細(xì)過程 已有2人參與
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Real-Time PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，利用熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增物量的變化，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)未知模板進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)定量的方法。 實(shí)驗(yàn)流程： 1、設(shè)計(jì)并合成Real-Time PCR引物 2、引物溶解后使用TaqDNA聚合酶進(jìn)行SG PCR反應(yīng) 3、客戶樣品RNA抽提 原裝進(jìn)口TRIZOL試劑進(jìn)行樣品RNA勻漿抽提 4、RNA質(zhì)量檢測(cè) 將抽提RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)抽提RNA純度及完整性 5、使用原裝進(jìn)口逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 6、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 進(jìn)行相對(duì)定量，需要先將樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用作標(biāo)準(zhǔn)曲線 7、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測(cè)樣品分別加入到含有SG的RT-PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增 8、檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 以對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測(cè)得值除以管家基因測(cè)得值以矯正誤差，所得結(jié)果為某樣品目的基因的相對(duì)含量。 南京百世金生物技術(shù)有限公司 |
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