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cgkbhf新蟲 (初入文壇)
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[求助]
ELISA提高抗原抗體特異性結(jié)合 已有1人參與
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請(qǐng)教各位大神！ 我最近在做ELISA，先在酶標(biāo)板包被抗原，然后加入少量能夠和抗原特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體（按理論計(jì)算抗原摩爾量遠(yuǎn)大于酶標(biāo)抗體），發(fā)現(xiàn)就算是怎么增大包被抗原量，酶標(biāo)抗體（始終定量）最多只能減少30%（通過測(cè)反應(yīng)前后OD值確定），感覺抗原飽和了，為什么會(huì)出現(xiàn)這種情況？我想至少結(jié)合60%，該怎么做？我只有5金幣了，各位大神幫忙分析一下。感激不盡�。�！ |
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cgkbhf
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可能我表述不太清楚，我的實(shí)驗(yàn)步揍是這樣的： 1 包被抗原 2 封閉特異性結(jié)合位點(diǎn) 3 加入200ul酶標(biāo)抗體，（加入前已測(cè)過OD值） 4 反應(yīng)后將溶液吸出，測(cè)OD值，與加入前的OD做對(duì)比，分析酶標(biāo)抗體被抗原結(jié)合多少 5 清洗板孔，加入顯色液，終止液，測(cè)板孔OD值。驗(yàn)證酶標(biāo)抗體減少量對(duì)應(yīng)OD值是否與板孔增加OD值一致。 6 增大包被抗原量，仍加入200ul同等濃度的酶標(biāo)抗體，（目的是將這定量酶標(biāo)抗體全部被抗原結(jié)合）測(cè)反應(yīng)前后酶標(biāo)抗體的減少。 7 將溶液吸出，清洗板孔，加入200ul 更大濃度酶標(biāo)抗體，看板孔OD值是否增加。 問題：不斷增大包被抗原量，200ul酶標(biāo)抗體反應(yīng)后只能被抗原結(jié)合30%（通過測(cè)反應(yīng)前后OD值，與標(biāo)線對(duì)比，反應(yīng)前后酶標(biāo)抗體濃度減少30%） 但是在加入更大濃度的酶標(biāo)抗體后，板孔OD值仍在增加，說明仍有未被占據(jù)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，為什么在低濃度的酶標(biāo)抗體溶液中，該位點(diǎn)不能結(jié)合抗體。是達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡了嗎？ |
7樓2015-12-07 22:50:01
2樓2015-12-06 10:22:31
cgkbhf
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3樓2015-12-06 20:15:09
yyy0305
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cgkbhf: 金幣+5, ★★★很有幫助, 有幫助，謝謝了��！ 2015-12-08 19:05:02
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cgkbhf: 金幣+5, ★★★很有幫助, 有幫助，謝謝了��！ 2015-12-08 19:05:02
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不知道題主設(shè)計(jì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是什么？是進(jìn)行抗體的定量還是進(jìn)行抗原和抗體結(jié)合活性的測(cè)量？ 看樣子像是想進(jìn)行抗原抗體結(jié)合活性的測(cè)量，這個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案應(yīng)該是包被少量的抗原，抗體做梯度稀釋，然后OD值進(jìn)行四參數(shù)擬合，理論上在抗體濃度較高時(shí)幾個(gè)點(diǎn)，信號(hào)會(huì)在平臺(tái)期，后面會(huì)隨濃度下降，抗體的信號(hào)也會(huì)下降，結(jié)合60%的點(diǎn)這個(gè)時(shí)候是能找到的。 抗原要是過量包被的話，定量的抗體都結(jié)合上去了，信號(hào)當(dāng)然不會(huì)有太大變化。 注意OD值讀數(shù)一般儀器的檢測(cè)極限在3.5-4之間，如果信號(hào)在這個(gè)范圍內(nèi)，信號(hào)值可能就不在線性范圍了，信號(hào)不可信，也就是說信號(hào)不能真實(shí)反饋結(jié)合的強(qiáng)弱了 |
4樓2015-12-06 21:02:49
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