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cgkbhf新蟲 (初入文壇)
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[求助]
ELISA提高抗原抗體特異性結(jié)合 已有1人參與
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請教各位大神！ 我最近在做ELISA，先在酶標(biāo)板包被抗原，然后加入少量能夠和抗原特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體（按理論計算抗原摩爾量遠(yuǎn)大于酶標(biāo)抗體），發(fā)現(xiàn)就算是怎么增大包被抗原量，酶標(biāo)抗體（始終定量）最多只能減少30%（通過測反應(yīng)前后OD值確定），感覺抗原飽和了，為什么會出現(xiàn)這種情況？我想至少結(jié)合60%，該怎么做？我只有5金幣了，各位大神幫忙分析一下。感激不盡�。�！ |
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2樓2015-12-06 10:22:31
cgkbhf
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cgkbhf: 金幣+5, ★★★很有幫助, 有幫助，謝謝了��！ 2015-12-08 19:05:02
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不知道題主設(shè)計這個實(shí)驗的目的是什么？是進(jìn)行抗體的定量還是進(jìn)行抗原和抗體結(jié)合活性的測量？ 看樣子像是想進(jìn)行抗原抗體結(jié)合活性的測量，這個實(shí)驗的設(shè)計方案應(yīng)該是包被少量的抗原，抗體做梯度稀釋，然后OD值進(jìn)行四參數(shù)擬合，理論上在抗體濃度較高時幾個點(diǎn)，信號會在平臺期，后面會隨濃度下降，抗體的信號也會下降，結(jié)合60%的點(diǎn)這個時候是能找到的。 抗原要是過量包被的話，定量的抗體都結(jié)合上去了，信號當(dāng)然不會有太大變化。 注意OD值讀數(shù)一般儀器的檢測極限在3.5-4之間，如果信號在這個范圍內(nèi)，信號值可能就不在線性范圍了，信號不可信，也就是說信號不能真實(shí)反饋結(jié)合的強(qiáng)弱了 |
4樓2015-12-06 21:02:49
cgkbhf
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5樓2015-12-06 22:03:05
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【答案】應(yīng)助回帖
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固定在酶標(biāo)板上的是抗體？一般固定在酶標(biāo)板上的物質(zhì)，只有10-15%是有活力的，這個見附件。隨著抗原的量增加，如果信號到了平臺期就說明抗體已經(jīng)完全結(jié)合上了，不知道題主30%是怎么得出來的 |
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2015-12-06 22:50:51, 171.12 K
6樓2015-12-06 22:51:02
cgkbhf
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可能我表述不太清楚，我的實(shí)驗步揍是這樣的： 1 包被抗原 2 封閉特異性結(jié)合位點(diǎn) 3 加入200ul酶標(biāo)抗體，（加入前已測過OD值） 4 反應(yīng)后將溶液吸出，測OD值，與加入前的OD做對比，分析酶標(biāo)抗體被抗原結(jié)合多少 5 清洗板孔，加入顯色液，終止液，測板孔OD值。驗證酶標(biāo)抗體減少量對應(yīng)OD值是否與板孔增加OD值一致。 6 增大包被抗原量，仍加入200ul同等濃度的酶標(biāo)抗體，（目的是將這定量酶標(biāo)抗體全部被抗原結(jié)合）測反應(yīng)前后酶標(biāo)抗體的減少。 7 將溶液吸出，清洗板孔，加入200ul 更大濃度酶標(biāo)抗體，看板孔OD值是否增加。 問題：不斷增大包被抗原量，200ul酶標(biāo)抗體反應(yīng)后只能被抗原結(jié)合30%（通過測反應(yīng)前后OD值，與標(biāo)線對比，反應(yīng)前后酶標(biāo)抗體濃度減少30%） 但是在加入更大濃度的酶標(biāo)抗體后，板孔OD值仍在增加，說明仍有未被占據(jù)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，為什么在低濃度的酶標(biāo)抗體溶液中，該位點(diǎn)不能結(jié)合抗體。是達(dá)到動態(tài)平衡了嗎？ |
7樓2015-12-07 22:50:01
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【答案】應(yīng)助回帖
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我知道你的實(shí)驗過程了，但是我還是沒弄清楚你的實(shí)驗?zāi)康�。有幾點(diǎn)可以討論一下1.拿酶標(biāo)抗體減少的OD值和顯色的OD值比較是沒有意義的。具體請查看朗伯比爾定律。他們有不同的吸光系數(shù)。2.如果需要抗原全部占據(jù)，你包被的抗原必須是少量的，請根據(jù)抗原和酶聯(lián)抗體的摩爾分子量進(jìn)行計算，而且是遠(yuǎn)遠(yuǎn)少量的1:10左右，這樣應(yīng)該有平臺期出現(xiàn)，酶聯(lián)不同加入濃度實(shí)驗，請同時做，這樣好找平臺期 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2015-12-08 07:50:22
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9樓2015-12-08 10:02:36
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抗原抗體反應(yīng)是可逆的，會最后形成動態(tài)平衡，如果抗原過量不行的話，你只有抗體少量了，酶聯(lián)抗體的稀釋倍數(shù)你看能不能調(diào)整 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2015-12-08 12:05:31
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