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淘七九懶鐵桿木蟲(chóng) (著名寫手)
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[交流]
一步克隆法隨機(jī)建庫(kù)！急求大神幫忙�。�！
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| 情況：最近在用蛋白工程的相關(guān)工作，主要是做建立隨機(jī)突變文庫(kù)，我用的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增的目的條帶，引物是用諾唯贊的一步克隆法試劑盒相關(guān)軟件設(shè)計(jì)的，引物應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，在做易錯(cuò)PCR的時(shí)候，我改變的是Mg2+、Mn2+的濃度，然后載體用的是我之前構(gòu)建好的，帶有目的片段的B-pet28載體，然后雙酶切(BamHI/XhoI)獲得線性的pet28,連接的時(shí)候先估測(cè)濃度，按照說(shuō)明書上加的，轉(zhuǎn)入BL21后卡那板上根本就不長(zhǎng)或者就一兩個(gè)�，F(xiàn)在我正在努力找原因，希望有用過(guò)一步克隆法試劑盒的人提供些幫助，給些建議，多謝多謝啦 |
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2樓2015-12-07 10:46:59
janjanjanjan
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-01-24 22:20:15
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| 竟然沒(méi)有回復(fù)。同樣用諾唯贊的一步克隆法，我試過(guò)好幾個(gè)片段和載體重組連接的比例，最好確定的長(zhǎng)得比較多的并不是推薦的比例。我們實(shí)驗(yàn)室?guī)熜种v說(shuō)，各種膠回收產(chǎn)物的純度很重要，我都是用水洗脫的膠回收產(chǎn)物。而且我用的是買的感受態(tài)。買的確實(shí)比自己做的長(zhǎng)的多。想問(wèn)下你的突變率是怎么確定的，交流下，我也在做易錯(cuò)pcr建庫(kù)。 |
3樓2016-01-24 20:19:47
淘七九懶
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4樓2016-01-25 21:01:25
潔123
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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你好，我想問(wèn)一下米的問(wèn)題解決了嗎？酶切，連接以后是直接電轉(zhuǎn)到你的宿主菌里了嗎？我現(xiàn)在也在做突變建庫(kù)，連接后產(chǎn)物直接電轉(zhuǎn)效率并不好。想請(qǐng)問(wèn)有什么建議嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
5樓2017-11-18 10:43:53
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