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Tricine—SDS—PAGE電泳分析小分子多肽 已有2人參與
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物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍在 10～200 kDa，對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量小于 10kDa的多肽分辨率低uJ。Swank等在含有 SDS的凝膠中加人 8mol·LI1的脲，但分離效果不甚理想，且重 現(xiàn)性較差。Lanzilo等發(fā)現(xiàn)在Laemmli系統(tǒng)和僅在樣品和電極緩沖液中有 SDS的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中，低分子量多肽常常堆積在濃縮膠中【2l，之后 Scba~ r等【3]又進(jìn)行 了系統(tǒng)地研究和探索，能夠分離較大相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì).隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和基因工程藥物的大量涌現(xiàn)，具有高生物活性的小分子多肽的分離、純化和鑒定技術(shù)極為重要。本文報(bào)道采用 Tris．Tricine緩沖體系，對(duì) SDS-PAGE方法的各個(gè) 環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)，在較低的丙烯酰胺濃度下取得了較理想的結(jié)果。 1 材料和方法 1．1 試劑和儀器 SDS為華美生物工程公司產(chǎn)品；丙烯酰胺 (分析 純)為上海綠鳥科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；N—N’甲叉 雙丙烯酰胺 (分 析純 )為 Fluka公 司產(chǎn)品；Tris為 PI'咖e 公司產(chǎn)品；Tricine、TEMED、過硫酸銨均為上 海生工 AMRKSCO分裝產(chǎn) 品；脲 (分 析純)為無錫市 民豐試劑廠產(chǎn)品 ；肽分子量標(biāo)準(zhǔn) 的分子量范圍1060 ～ 266OO為美國 Sigma公司產(chǎn)品。EPS604穩(wěn)壓穩(wěn)流 電泳儀(南京科寶儀器研究所)；小型垂直電泳附件1．2．2 膠的制備 在垂直電泳附件模具中，按表 3給 出的數(shù)據(jù)依次灌注分離膠、間隙膠和濃縮膠，采用 4種不同的分 離膠配比方法，進(jìn)行 比較實(shí)驗(yàn)。 1．2．3 電泳 分別按表 1的組 成加陽極及陰極緩沖液，先 60V電泳 1h，當(dāng)樣品進(jìn)人分離膠時(shí)，將實(shí)驗(yàn)的電壓 分別升到 100V，85V，95V，95 V進(jìn)行 比較，直至樣 品中染料遷移至離下端 1cm時(shí)停止. 多肽 取出平板中的凝膠立即浸泡于固定液 (50％乙醇，10％冰 乙酸 )中固定 1h，再將 固定后的凝膠置于45℃的染色液 (1g·L 考馬斯亮藍(lán) R-250的 25％乙醇，8％冰乙酸 )中浸泡 l5～30min，然后用蒸餾水將凝膠淋洗一次，最后，多次變換脫色液(25％乙醇，8％冰乙酸，以上均為體積分?jǐn)?shù))，直至凝膠上背景脫凈為 I七。 2 結(jié)果和討論 4種不同類型膠的蛋白標(biāo)準(zhǔn)分離結(jié)果如圖 1。對(duì)后兩種類型膠的分離結(jié)果以其 w對(duì)數(shù) (1gMw)和在分離膠中的相對(duì)遷移率( ，)進(jìn)行了直線回歸分析(圖 2)，相關(guān) 系數(shù) r分別為 0．896和 0．892。 多肽合成 由圖 1可 以看出，分離膠 0．1T，3％C的 SDS-PAGE電泳可以分析分辨 5kDa以上的蛋白，該類型的膠相對(duì)于其它類型膠來說產(chǎn)生的熱量較小，但是低于5000Da的多肽很難分辨。分離膠．0．165T，3％C圖 1 4種不同類型膠分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白的 SDS-PAGE可 比較清楚地分離 3kDa以上的多肽，而 1kDa相近的蛋白帶無法觀察，若低于5000Da的多肽分離不很重要的話，完全可以省去間隙膠的使用；分離膠 0．165T，6％C(不 含脲 )的 SDS-PAGE電泳對(duì)于 1～20kDa的多肽有很好的分辨率。在第 4種類型的分離膠中添加脲，如 Swank和 Munkres所述，低于5000Da的蛋白條帶清晰度增加。脲使用 與否的主要區(qū)別在于蛋白的具體性質(zhì)，有些蛋白沒有脲時(shí)分離效果更好，但是有些蛋白的分離就需要 子多肽的擴(kuò)散、丟失。在含 SDS緩沖液 的樣品中， 添加脲時(shí)才能更好分辨。但在一般小分子肽的分離 小分子多肽的濃縮是較困難的 ，因?yàn)樾》肿佣嚯呐c 中，有無脲的添加對(duì)電泳結(jié)果無明顯影響。根據(jù)相 SDS形成的復(fù)合體具有與 SDS本身類似的電荷和大 對(duì)遷移率與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的曲線 (圖 小，因此濃縮對(duì)于小分子多肽的 SDS-PAGE來說就 2)可見，5種蛋白的計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量精確度為 成了一個(gè)突出的問題【4J。 多肽合成圖片 多肽合成圖片1 我們采用的方法中利用 ±10％，屬于電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量的正常誤差 Tficme緩沖體系，分離膠和濃縮膠中采用相同的 pH 范圍。僅有最低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白( l06o) 值，并在較低的丙烯酰胺濃度的電泳條件下，使小分的計(jì)算值與實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量有一定差異，這主要是因?yàn)樾‰牡南鄬?duì)分子質(zhì)量越小，其固有電荷及其構(gòu)象對(duì)泳動(dòng)率的影響就越大。以上結(jié)果表明該法在實(shí)際工作中可為研究者提供較為可靠的分離條件及分析結(jié)果。SDS-PAGE電泳的有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，相對(duì)分子質(zhì)量低 于10000的小分子肽即使用較高濃度的聚丙烯酰胺也不能完全分離。我們通過比較發(fā)現(xiàn)，采用分離膠 0．165T，6％C(含或不含脲 )的梯度膠電泳 ，即可把標(biāo)準(zhǔn)品的6條帶顯示得非常清楚，上樣量小，重復(fù)性好。固定、染色和脫色過程中未使用甲醇，且在電泳后通過加熱速染色避免了凝膠的膨脹變形，而且 甲醇會(huì)使sDS_蛋白復(fù)合體中的 SDS游離出來而導(dǎo)致一些小分子多肽能夠有效地壓縮和去壓縮。而且電泳體系中不使用甘氨酸和脲，可以為后來的氨基酸序列測(cè)定免除干擾。 原文地址：ontores-新浪博客 |
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