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alice keer新蟲 (初入文壇)
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[求助]
真菌菌絲提取及電泳圖求解釋！ 已有1人參與
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用CTAB提取法提取真菌DNA,但是抽提DNA過程中只用了氯仿/異戊醇（24:1），沒有使用Tris飽和酚抽提。在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測有無條帶，如下圖所示，請教各位大神：這是什么原因？ 急需，感激不盡。。。。。。 20151216DNA(SHEN).jpg |
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2樓2015-12-17 15:51:36
angelyou
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3樓2015-12-17 21:24:18
alice keer
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4樓2015-12-19 10:31:19
alice keer
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1、用滅菌刀片（一般用酒精蘸取后在酒精燈上灼燒），刮取菌絲置于研缽中，加入適量石英砂和液氮迅速研磨2-3次確保磨成細粉（注意帶厚手套防凍及確保研磨過程中一直有液氮保護，最后一次研磨完倒入液氮保護，等待轉(zhuǎn)移到離心管中） 2、將研缽中的細粉迅速轉(zhuǎn)移到1.5ML的離心管中，加入65℃預(yù)熱的800ul 2%CTAB提取緩沖液和80ul10%SDS（也可以不用SDS），快速混勻，65℃水浴30-60Min，5-10min輕柔振蕩一次。 3、12000rpm常溫離心5min（一般也用10min），緩慢吸取上清液于一個新的離心管中（注意：有些離心完上層有Pr固體，吸取時注意不要吸到Pr等固體層），加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）混合液抽提2次（有些也用氯仿和異戊醇或只用氯仿），10000-12000rpm離心10min 4、緩慢吸取上清液于一個新的離心管中，緩慢加入2.5體積的異丙醇（去除多糖）無水乙醇，再加入0.1體積的3mol/L的NaAC（注意順序）-20℃沉淀過夜 5、10000-12000rpm離心10min，丟棄上清液（倒置使管壁液體流干凈） 6、加入70%乙醇漂洗2次 7、斜拿離心管，用移液槍從沉淀的對面緊貼管壁處輕輕吸出乙醇，在室溫中敞蓋干燥 8、所得沉淀溶于50ulTE緩沖液（或者ddH2O，雙蒸水是其中的一種）中，最后置于-20℃保存 |
5樓2015-12-19 10:33:01
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The 4th step would be the problem. The order is different from my CTAB protocol, which is "Add 0.5 volume 5M NaCl and mix properly. Then add 2/3 volume ice-cold isopropanol and leave at least 20minutes (up to overnight) at -20 degrees Celsiu." It must be pointed out that once DNA and polysaccharides co-precipitate together, it becomes much more difficult to separate them than prior to precipitation. By adding 0.5 volum 5M NaCl to the CI-extracted aqueous solution just prior to precipitation by isopropanol, it is effectivly separate the DNA from polysaccarides. In my opinion, this step is the key to CTAB protocol. |
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2016-01-08 16:09:12, 50.16 K
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alice keer6樓2016-01-08 16:09:13
alice keer
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7樓2017-04-01 10:10:23
8樓2017-07-30 21:00:27
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