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測(cè)序結(jié)果少了500bp可是PCR結(jié)果完全正確
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各位高手，我是新手，請(qǐng)大家不吝賜教。 我半年前克隆了一個(gè)大片段基因簇 （大概有80KB）到BAC里面，然后想做異源表達(dá)，可是發(fā)現(xiàn)不了目標(biāo)產(chǎn)物，因此懷疑是基因簇在克隆時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤。所以我就把這個(gè)質(zhì)粒提取出來(lái)交給商業(yè)機(jī)構(gòu)測(cè)序，結(jié)果出來(lái)以后，我用NCBI去對(duì)比測(cè)序結(jié)果和真實(shí)的基因簇序列，結(jié)果顯示：除了基因簇中間的一個(gè)重要功能基因缺失了500 bp 以外，其余的結(jié)果都是100% 的 identity. 然后我深深地懷疑這個(gè)結(jié)果，總感覺(jué)不太可能，所以我就設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物，用來(lái)擴(kuò)增這些缺失的堿基，結(jié)果PCR是陽(yáng)性的，為了進(jìn)一步確認(rèn)，我又把這個(gè)PCR的產(chǎn)物提純測(cè)序，結(jié)果正是缺失的那500 bp. 對(duì)了忘了說(shuō)明，基因簇的測(cè)序結(jié)果就是從缺失部分地兩端開始讀取和結(jié)束的，會(huì)不會(huì)是這個(gè)原因呢？菜鳥一個(gè)，說(shuō)的不明白請(qǐng)諒解，如果各位達(dá)人有什么疑問(wèn)，我可以補(bǔ)充，快要被這個(gè)問(wèn)題煩死了。下面畫了一個(gè)草圖，新手金幣不多，萬(wàn)分感謝。 Picture1.jpg |
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2樓2016-01-04 07:14:08
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謝謝您的回復(fù)，我就是用NCBI的nucleotide blast對(duì)比的啊，一點(diǎn)一點(diǎn)的找，最后發(fā)現(xiàn)了500 bp的缺失 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-01-04 07:18:13
4樓2016-01-04 07:21:27
5樓2016-01-04 07:27:12
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這樣的話就是測(cè)序或他們拼接問(wèn)題了，你的沒(méi)目的產(chǎn)物？那得從表達(dá)方面找問(wèn)題了，還有是高保真酶擴(kuò)的么？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-01-04 07:34:01
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不是高保真，但PCR產(chǎn)物也測(cè)序了，沒(méi)問(wèn)題。您說(shuō)的對(duì)，我下一步準(zhǔn)備往里面塞強(qiáng)啟動(dòng)子，但是想先百分百確定基因簇沒(méi)有問(wèn)題 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
7樓2016-01-04 07:57:28
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建議換個(gè)機(jī)構(gòu)再測(cè)試一次，測(cè)試的是能夠覆蓋500bp的新的PCR片段，你前后多加個(gè)1000bp足夠了吧。 另外，我還真是沒(méi)有見(jiàn)過(guò)插入80kb的片段的質(zhì)粒，什么質(zhì)粒，可以插入那么大片段。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-01-04 08:14:59
9樓2016-01-04 10:58:58
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