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wj2423311236銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于寶生物xho1酶的連接問題 已有2人參與
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| 最近在做雙酶切后的連接，連續(xù)兩次了做不出來，使用的酶是bamh1和xho1，其中xho1的說明書上說要用平末端的連接條件，可是bamh1卻又要求黏末端的連接條件�，F(xiàn)在很糾結(jié)到底用那個(gè)條件。還有平末端的連接條件是什么？新手表示很困擾啊。用的酶是寶生物的，載體是pet28a。 |
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2樓2016-01-13 18:03:24
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3樓2016-01-13 18:19:06
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4樓2016-01-13 18:51:48
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5樓2016-01-13 19:18:53
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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您可以先將PCR產(chǎn)物連T載體（taq）或者平末端載體（pfu），抽提質(zhì)粒后，再用這兩個(gè)酶進(jìn)行雙酶切， 之后電泳回收目的片段，這樣能夠保證回收到的片段一定是有粘性末端的。連接成功率也會(huì)高很多。 若您直接將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，很難保證片段百分百被酶切。并且限制性內(nèi)切酶在DNA末端的酶切效率本身就很低，這種情況必須要添加保護(hù)堿基的。 若這兩種酶實(shí)在不適合雙酶切，也可以采用分步酶切法，即先單酶切，之后進(jìn)行產(chǎn)物純化，然后再進(jìn)行另外一個(gè)酶切，之后再純化，這樣的好處是每一次酶切都是相應(yīng)內(nèi)切酶的最佳反應(yīng)環(huán)境，但有致命缺點(diǎn)：經(jīng)過多次純化后的DNA片段濃度會(huì)很低。 |
6樓2016-01-14 12:48:26
wj2423311236
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7樓2016-01-14 17:37:45
8樓2016-01-27 12:03:45
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
9樓2020-12-29 11:15:46
10樓2020-12-31 18:18:58
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