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[求助]
His標(biāo)簽?zāi)揪厶敲覆粧熳? 已有4人參與
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已經(jīng)做了好幾次純化了，均不掛住，在穿透液里就流出來(lái)了，洗脫液里只有一點(diǎn)點(diǎn)，我是通過(guò)測(cè)木聚糖酶活來(lái)看的，看顏色的深淺。 我測(cè)的是Xyn-II等電點(diǎn)是8.7 具體做法是，1．緩沖液準(zhǔn)備 A液，1XTris-HCl緩沖液pH8.0，含有8~20mM咪唑 B液，1XTris-HCl緩沖液pH8.0，含有8~80mM咪唑 C液，1XTris-HCl緩沖液pH8.0，含有250mM咪唑 2．樣品的準(zhǔn)備 收集細(xì)菌或者細(xì)胞，以適當(dāng)體積的A液重懸，超聲破碎，或采用其他酶解方法破碎細(xì)胞，高速離心除去細(xì)胞碎片，取上清備用 3.親和層析柱的準(zhǔn)備 50%的瓊脂糖珠，顛倒重懸混勻，取1ml混懸液加入層析柱中，水分靠重力過(guò)濾除去，得到0.5ml柱床體積的瓊脂糖珠。加入5倍柱床體積的A液（2.5ml）平衡瓊脂糖珠。 4.上樣 上述步驟2得到的上清，分批加入層析柱，過(guò)濾流出的液體為穿透液 5.以10倍柱床體積的B液，洗滌瓊脂糖珠，過(guò)濾流出的液體為洗滌液 6.以6倍柱床體積的C液，洗脫蛋白（洗脫的蛋白一般在第一體積和第二體積，第三積僅有很少量。一般第一體積雜蛋白較多，第二體積蛋白較純）過(guò)濾流出的液體為洗脫液 完全按照說(shuō)明書(shū)來(lái)做的 后來(lái)導(dǎo)師說(shuō)是不掛住，我就用了8M的尿素，直接加到上述2樣品準(zhǔn)備的粗酶液里孵育半小時(shí)，可是還是不掛住~我用的質(zhì)粒時(shí)老板從外國(guó)要過(guò)來(lái)了，有原始論文，論文里用的是陽(yáng)離子交換色譜法，導(dǎo)師讓我 用NI-NTA親和層析，研一剛接觸試驗(yàn)，有好多不太明白的地方，希望大家授業(yè)解惑~~感激不盡~ |
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pennchem
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