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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » His標簽木聚糖酶不掛住
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His標簽木聚糖酶不掛住 已有4人參與
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已經(jīng)做了好幾次純化了，均不掛住，在穿透液里就流出來了，洗脫液里只有一點點，我是通過測木聚糖酶活來看的，看顏色的深淺。 我測的是Xyn-II等電點是8.7 具體做法是，1．緩沖液準備 A液，1XTris-HCl緩沖液pH8.0，含有8~20mM咪唑 B液，1XTris-HCl緩沖液pH8.0，含有8~80mM咪唑 C液，1XTris-HCl緩沖液pH8.0，含有250mM咪唑 2．樣品的準備 收集細菌或者細胞，以適當體積的A液重懸，超聲破碎，或采用其他酶解方法破碎細胞，高速離心除去細胞碎片，取上清備用 3.親和層析柱的準備 50%的瓊脂糖珠，顛倒重懸混勻，取1ml混懸液加入層析柱中，水分靠重力過濾除去，得到0.5ml柱床體積的瓊脂糖珠。加入5倍柱床體積的A液（2.5ml）平衡瓊脂糖珠。 4.上樣 上述步驟2得到的上清，分批加入層析柱，過濾流出的液體為穿透液 5.以10倍柱床體積的B液，洗滌瓊脂糖珠，過濾流出的液體為洗滌液 6.以6倍柱床體積的C液，洗脫蛋白（洗脫的蛋白一般在第一體積和第二體積，第三積僅有很少量。一般第一體積雜蛋白較多，第二體積蛋白較純）過濾流出的液體為洗脫液 完全按照說明書來做的 后來導師說是不掛住，我就用了8M的尿素，直接加到上述2樣品準備的粗酶液里孵育半小時，可是還是不掛住~我用的質(zhì)粒時老板從外國要過來了，有原始論文，論文里用的是陽離子交換色譜法，導師讓我 用NI-NTA親和層析，研一剛接觸試驗，有好多不太明白的地方，希望大家授業(yè)解惑~~感激不盡~ |
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bright8
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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換載體吧！這個可能就是蛋白表達的時候,his_tag包裹再里面了，沒有暴露在蛋白的外面了，導致不掛柱啦！建議換載體試一試或者按照別人文獻的方法試一下。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-01-16 22:11:34
2樓2016-01-16 16:23:12
pennchem
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- 專業(yè): 生物大分子結構與功能
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3樓2016-01-16 17:16:28
4樓2016-01-16 17:38:50
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