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比較基礎，適合新蟲學習！ 一、裝柱 裝柱子（添硅膠）時，常用的有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。 不論干法還是濕法，硅膠（稱為固定相更為廣義）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右（長度沒有絕對之說，根據自身情況而定，制備的大柱可以長達一米），太短了可能分離效果不好，太長了也會由于擴散或拖尾導致分離效果不好。 濕法裝柱是先把硅膠用適當的溶劑拌勻后，再填入柱子中，然后再加壓（土方法可以用養(yǎng)魚的氧氣泵加壓或是用氮氣，當然不加壓也可以）用淋洗劑"走柱子"，本法最大的優(yōu)點是一般柱子裝的比較結實，沒有氣泡。 （我一般都用濕法裝柱） 干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側（濕法也要敲的，效果好點），至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會使得柱子裝的很結實（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接著是用淋洗劑"走柱子"，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于"走柱子"時，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到）（梯度洗脫時，濕法裝柱也會出現(xiàn)該情況，比較不好處理，可以緩慢改變溶劑，且置于通風處），容易產生氣泡，這一點在使用低沸點的淋洗劑時如乙醚（用乙醚最最明顯），二氯甲烷更為明顯。雖然產生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時候，氣泡就會釋放出來，嚴重時，整個柱子變花，樣品不可能平整地通過，當然也就談不上分離了。 解決的辦法是： 第一、硅膠一定要壓結實； 第二、 一定要用較多的溶劑"走柱子"，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復到室溫后再撤去壓力。 也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂(我一般墊張濾紙，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶劑的時候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個必要。 二、上樣 上樣也有干法和濕法之分： 干法（也稱硅膠制沙）就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。（我一般喜歡用這種方法，除非不能用） 濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉移得到的溶液，沿著層析柱內壁均勻加入。然后用少量溶劑洗滌后，再加入。 濕法較方便，但不溶劑讓其完全被硅膠均勻吸附，不容易跑的很平整 柱層析關鍵在于柱子是否裝好（這是最大影響因素）和淋洗劑是否選擇恰當。而淋洗劑的選擇則是通過TLC確定。這里要指出的一點是：TLC（作用還是很大的）的作用除了跟蹤反應進程，檢測試劑和原料純度外，一個重要的用途就是為柱層析選擇適當的淋洗劑。 上樣完畢后，接著即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使 用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴散作用來分離，效果也不會好。（這一點很實用，不過有些特殊情況也不一定，如果要保險可以先做根小柱子跑一下，這樣最安全，就是花點時間） 三、收集 主要依靠TLC（據說國外有石英柱，直接用熒光燈照能看出來，不過太貴了，在國內不一定適用），需要切記的是： 第一、某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。因此在尋找展開劑時，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開劑。展開劑的極性太小，點分不開，極性太大，也分不開.一般以目標產物的Rf值在0.3左右為最佳。 第二、點不能點得太濃（在最后時應該點的濃點，這樣看看有無收盡產品）,否則容易重疊,不易判斷,因為如果兩個點相近的話,一濃就變成一個點了。 第三、板上點的展開的清晰程度和溶劑的極性和物質在該溶劑中的溶解性有關，只有兩者比較合適才能有一個交好的分離效果。 選擇適當的展開劑是首要任務.一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚 展開劑的比例要靠嘗試. 一般根據文獻（這是首選）中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。 很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到最佳效果。不行可以嘗試兩兩混合，三者混合，一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例,達到最佳效果，如果沒有分開的跡象，最好是換溶劑。 在利用TLC跟蹤反應時，在點板的時候往往是反應體系的混和溶液點一個點A，每種難揮發(fā)的原料各點一個點B,C, D等等，然后所有的原料和反應體系的混合溶劑再共同點 一個混合點X，這些點在板上的位置如圖所示： A X B C D 這樣的好處是展開后可以清楚地看見每個點的位置，把A這個點展開后的各個層份的 點與B,C,等原料比較，從而判斷原料消失沒有，點混合點X的目的在于，方便觀察，因為有時候，板展開后，各點的位置有些變形，或者由于邊緣效應等等，使得判斷不易。（我喜歡用小板，跑的快，很快見到結果，為了避免小板的邊緣，用機器板較好） 利用TLC判斷物質的純度時，如果不能完全確定，可以再結合其他檢測手段，如NMR，因為某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。 但有趣的是，由于H-NMR可鑒別 的純度也就在95%左右，有時候H NMR現(xiàn)示較純的東西，一點板就會發(fā)現(xiàn)有幾個點。所以，兩者要結合使用。如果有標準品或是以前做過的，對個對照最方便。 [ Last edited by 風之惑 on 2008-10-7 at 12:09 ] |
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