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跑柱經(jīng)驗(yàn)分享（轉(zhuǎn)帖+個(gè)人經(jīng)驗(yàn)）
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比較基礎(chǔ)，適合新蟲學(xué)習(xí)！ 一、裝柱 裝柱子（添硅膠）時(shí)，常用的有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。 不論干法還是濕法，硅膠（稱為固定相更為廣義）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右（長(zhǎng)度沒有絕對(duì)之說，根據(jù)自身情況而定，制備的大柱可以長(zhǎng)達(dá)一米），太短了可能分離效果不好，太長(zhǎng)了也會(huì)由于擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致分離效果不好。 濕法裝柱是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇┌鑴蚝螅偬钊胫又�，然后再加壓�?font color="Red" class="Red_ext">土方法可以用養(yǎng)魚的氧氣泵加壓或是用氮?dú)猓?dāng)然不加壓也可以）用淋洗劑"走柱子"，本法最大的優(yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒有氣泡。 （我一般都用濕法裝柱） 干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)（濕法也要敲的，效果好點(diǎn)），至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接著是用淋洗劑"走柱子"，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于"走柱子"時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到）（梯度洗脫時(shí)，濕法裝柱也會(huì)出現(xiàn)該情況，比較不好處理，可以緩慢改變?nèi)軇�，且置于通風(fēng)處），容易產(chǎn)生氣泡，這一點(diǎn)在使用低沸點(diǎn)的淋洗劑時(shí)如乙醚（用乙醚最最明顯），二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時(shí)候，氣泡就會(huì)釋放出來，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子變花，樣品不可能平整地通過，當(dāng)然也就談不上分離了。 解決的辦法是： 第一、硅膠一定要壓結(jié)實(shí)； 第二、 一定要用較多的溶劑"走柱子"，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。 也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂(我一般墊張濾紙，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶劑的時(shí)候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個(gè)必要。 二、上樣 上樣也有干法和濕法之分： 干法（也稱硅膠制沙）就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。（我一般喜歡用這種方法，除非不能用） 濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。然后用少量溶劑洗滌后，再加入。 濕法較方便，但不溶劑讓其完全被硅膠均勻吸附，不容易跑的很平整 柱層析關(guān)鍵在于柱子是否裝好（這是最大影響因素）和淋洗劑是否選擇恰當(dāng)。而淋洗劑的選擇則是通過TLC確定。這里要指出的一點(diǎn)是：TLC（作用還是很大的）的作用除了跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，檢測(cè)試劑和原料純度外，一個(gè)重要的用途就是為柱層析選擇適當(dāng)?shù)牧芟磩?br /> 上樣完畢后，接著即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使 用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時(shí)，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴(kuò)散作用來分離，效果也不會(huì)好。（這一點(diǎn)很實(shí)用，不過有些特殊情況也不一定，如果要保險(xiǎn)可以先做根小柱子跑一下，這樣最安全，就是花點(diǎn)時(shí)間） 三、收集 主要依靠TLC（據(jù)說國(guó)外有石英柱，直接用熒光燈照能看出來，不過太貴了，在國(guó)內(nèi)不一定適用），需要切記的是： 第一、某種樣品在這種展開劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。因此在尋找展開劑時(shí)，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開劑。展開劑的極性太小，點(diǎn)分不開，極性太大，也分不開.一般以目標(biāo)產(chǎn)物的Rf值在0.3左右為最佳。 第二、點(diǎn)不能點(diǎn)得太濃（在最后時(shí)應(yīng)該點(diǎn)的濃點(diǎn)，這樣看看有無收盡產(chǎn)品）,否則容易重疊,不易判斷,因?yàn)槿绻麅蓚�(gè)點(diǎn)相近的話,一濃就變成一個(gè)點(diǎn)了。 第三、板上點(diǎn)的展開的清晰程度和溶劑的極性和物質(zhì)在該溶劑中的溶解性有關(guān)，只有兩者比較合適才能有一個(gè)交好的分離效果。 選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑是首要任務(wù).一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚 展開劑的比例要靠嘗試. 一般根據(jù)文獻(xiàn)（這是首選）中報(bào)道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)分離效果好的展開劑。 很多時(shí)候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達(dá)到最佳效果。不行可以嘗試兩兩混合，三者混合，一般把兩種溶劑混合時(shí),采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調(diào)整比例,達(dá)到最佳效果，如果沒有分開的跡象，最好是換溶劑。 在利用TLC跟蹤反應(yīng)時(shí)，在點(diǎn)板的時(shí)候往往是反應(yīng)體系的混和溶液點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)A，每種難揮發(fā)的原料各點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)B,C, D等等，然后所有的原料和反應(yīng)體系的混合溶劑再共同點(diǎn) 一個(gè)混合點(diǎn)X，這些點(diǎn)在板上的位置如圖所示： A X B C D 這樣的好處是展開后可以清楚地看見每個(gè)點(diǎn)的位置，把A這個(gè)點(diǎn)展開后的各個(gè)層份的 點(diǎn)與B,C,等原料比較，從而判斷原料消失沒有，點(diǎn)混合點(diǎn)X的目的在于，方便觀察，因?yàn)橛袝r(shí)候，板展開后，各點(diǎn)的位置有些變形，或者由于邊緣效應(yīng)等等，使得判斷不易。（我喜歡用小板，跑的快，很快見到結(jié)果，為了避免小板的邊緣，用機(jī)器板較好） 利用TLC判斷物質(zhì)的純度時(shí)，如果不能完全確定，可以再結(jié)合其他檢測(cè)手段，如NMR，因?yàn)槟撤N樣品在這種展開劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。 但有趣的是，由于H-NMR可鑒別 的純度也就在95%左右，有時(shí)候H NMR現(xiàn)示較純的東西，一點(diǎn)板就會(huì)發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)點(diǎn)。所以，兩者要結(jié)合使用。如果有標(biāo)準(zhǔn)品或是以前做過的，對(duì)個(gè)對(duì)照最方便。 [ Last edited by 風(fēng)之惑 on 2008-10-7 at 12:09 ] |
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48樓2008-10-09 13:06:37
2樓2008-10-07 14:06:42
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