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會(huì)飛的魚622新蟲 (初入文壇)
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[求助]
假單胞菌 同源重組 插入突變 蔗糖篩選 已有2人參與
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各位大俠請(qǐng)求幫助 我做的是假單胞菌羧卞抗性的基因敲除試驗(yàn)，選用的自殺質(zhì)粒是PJQ200sk gent抗性，將基因的ATG上下游500-600bp片段擴(kuò)增出來，在ATG下游20bp左右插入卡那霉素抗性基因，然后連入PJQ200sk 1.進(jìn)行三親雜交，在卡那霉素和羧卞的平板上長(zhǎng)斑，pcr驗(yàn)證能夠檢測(cè)到突變后基因大小的片段，但是擴(kuò)增不出來假單胞菌其他的基因，蔗糖篩選后也一樣 2.進(jìn)行電轉(zhuǎn)，在卡那霉素和羧卞的平板上長(zhǎng)斑，菌液pcr目的基因和其他基因都擴(kuò)增不到，能再蔗糖板上張，也能在gent抗性的培養(yǎng)基中張 各位大俠幫幫忙 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2016-02-23 15:55:32
岳大白
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3樓2016-02-23 15:56:24
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-23 22:22:54
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-23 22:22:54
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是雜菌嗎？ 1 是否有g(shù)en的抗性？ 2 用單抗平板測(cè)試你的供體菌，受體菌和輔助菌確實(shí)能夠用來篩選，而沒有其它交叉的抗性 3 關(guān)于sacB的問題，在假單胞菌中本來就用的不大好，反正我們的是這樣 4 三親本后，挑取的單菌落多劃線幾次，然后用蔗糖篩選也是多劃線幾次--- ---別染雜菌了 5 主要看pcr的結(jié)果吧 sacB不是太好用，或者你的基因是條件致死了，長(zhǎng)出來的都是突變了的，那就搞不定了 |
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4樓2016-02-23 19:00:41
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是說我的雙抗篩選后獲得的單克隆是否有g(shù)ent抗性是嗎？ 我的電轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)化子是有g(shù)ent抗性的，三親結(jié)合沒試過是否有g(shù)ent抗性 我做的基因不是致死基因 抗生素交叉抗性的問題，我試過輔助菌和供體菌兩種菌不抗羧卞，受體菌不抗kana 麻煩幫我在分析一下可能還是哪些方面的問題 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-02-26 19:06:24
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7樓2016-12-07 01:11:58
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【答案】應(yīng)助回帖
| 你好 我的問題和你的一模一樣，我也是假單胞菌，我用的自殺質(zhì)粒是pEX18GM,輔助菌是pRK600,我也是三親后涂平板驗(yàn)證是對(duì)的（用敲出基因的1和4引物以及其他基因的引物都是有的，說明是單交換成功的菌），但是我再次挑目的菌在LB平板上劃線時(shí)，就一點(diǎn)也長(zhǎng)不出來了，偶爾會(huì)有一點(diǎn)點(diǎn)的菌長(zhǎng)出來，但是用假單胞菌的其他基因來擴(kuò)就擴(kuò)不出，而且蔗糖后用敲除的1和4 引物驗(yàn)證還是對(duì)的，但是假單胞菌的其他基因還是沒有，我就把蔗糖后的菌拿去測(cè)序，發(fā)現(xiàn)是大腸桿菌。我的猜測(cè)是單交換的假單胞菌死掉了（不明白為什么死掉，抗生素的選擇是合適的），在LB上長(zhǎng)出來的一點(diǎn)點(diǎn)的菌就是供體菌。但是為什么會(huì)這樣我就不明白了，這一步也是卡了很久了，請(qǐng)問你后來問題解決了嗎？？能否告知如何解決的，萬(wàn)分感謝�。� |
8樓2017-12-28 15:59:21
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