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真果粒新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒長(zhǎng)片段pcr及質(zhì)粒的重新構(gòu)建 已有2人參與
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準(zhǔn)備在一個(gè)購(gòu)買的一個(gè)質(zhì)粒（12kb）加一個(gè)基因，但由于沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)，所以準(zhǔn)備先將原質(zhì)粒進(jìn)行全長(zhǎng)pcr，并在引物上添加酶切位點(diǎn)，最后和目的基因連接構(gòu)建新的質(zhì)粒。但在p質(zhì)粒全長(zhǎng)的時(shí)候遇到如下圖（左邊兩泳道）的問(wèn)題。即：目的條帶較暗，而點(diǎn)樣孔里面較亮。LArtaq和primestar GXL兩種酶都用過(guò)，也差不多都這樣。反應(yīng)條件LArtaq：95℃：5min 94℃:45s (55-68℃)： 45s 72℃：11min 72℃：10min ，primestar GXL是根據(jù)其說(shuō)明書(shū)來(lái)的：（三步法）95℃：5min 98℃:10s (65℃和60℃均用過(guò))： 15s 72℃（說(shuō)明書(shū)上用的是68℃也用過(guò)）：11min(說(shuō)明書(shū)上超過(guò)10kb的延伸時(shí)間為10min，也試過(guò)) ;（兩步法）95℃：5min 98℃:10s 68℃：10min 68℃：10min。引物包裝上給出的溫度是70和72攝氏度（引物上加了酶切位點(diǎn)）。 各位大神，出現(xiàn)如圖的情況是啥原因？另外，進(jìn)行用上面的方法重構(gòu)質(zhì)粒的方法可行嗎？ 小木蟲(chóng).jpg |
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kangaroo0513
新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-22 22:41:56
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-22 22:41:56
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大的質(zhì)粒（>5kb）不推薦PCR擴(kuò)增，誰(shuí)知道在哪就突變了。。你又不可能擴(kuò)增完了把整個(gè)質(zhì)粒都測(cè)序了。。你看一下質(zhì)粒圖譜，看看兩邊有沒(méi)有單一酶切位點(diǎn)（不是你要插入基因的地方，而是再上游和下游）。有的話，就做overlap PCR，插入你的酶切位點(diǎn)就行了。 你是慢病毒載體么？我手里有很多慢病毒載體，需要的話可以站短我。。 |
2樓2016-02-22 15:09:13
3樓2016-02-22 16:24:16
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