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洋小妞baby新蟲 (初入文壇)
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[求助]
熒光定量PCR加入的模板量應(yīng)該是多少 已有1人參與
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想請教一下各位大神做熒光定量PCR反應(yīng)實(shí)驗時，按照說明書，反應(yīng)體系是20微升，加入的模板量應(yīng)該是多少合適呢？用內(nèi)參基因actin還有其他的幾個基因做了一下實(shí)驗，actin基因的CT值在21左右，其他的幾個基因的CT值也在20-25附近？ 是根據(jù)CT值大小來決定模板用量吧？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2017-08-11 20:28:13
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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假如模板分子有一個，那么經(jīng)過一輪PCR，就變成2個，這兩個經(jīng)過又一輪PCR，變成了4個，依次……，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過40輪，變成了2的40次方個，伴隨著每輪PCR有熒光探針的水解，根據(jù)熒光情況判斷原始產(chǎn)量，推算初始模板量。 我們實(shí)驗室一般是用500-1000ngRNA做RT，然后得到20μlcDNA，加入85μl H2O，等于總體積是105μl, 每次做qPCR的時候總體積是25μl: 12.5μl SYBR Green Taq 2x +6.5μl H2O + 0.5μl primer1 10μM +0.5μl primer2 10μM + 5μl cDNA 反正這個條件下我們的qPCR都能做出來，你可以做個參考 |
3樓2017-08-11 21:14:52
洋小妞baby
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好羨慕你們都說我們實(shí)驗室啊，嗚嗚嗚，研究生還沒入學(xué)，被老師逼著做實(shí)驗，實(shí)驗室之前只有一個博士師姐做分子方向，然而她已經(jīng)畢業(yè)了。我還想問一下每個重復(fù)孔的CT值的標(biāo)準(zhǔn)偏差多少合適呢 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-08-11 23:08:11
洋小妞baby
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5樓2017-08-11 23:08:55
zht930528
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6樓2017-08-16 11:03:01
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樓主，想問一下，我內(nèi)參的ct值都到35了，其他目的基因的ct值在21左右是正常的，內(nèi)參基因是人家做同種物種用的，很郁悶 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2017-10-31 17:14:21
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