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小木蟲論壇-學(xué)術(shù)科研互動(dòng)平臺(tái) » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關(guān) » 與PMD-19T連接問題

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【懸賞金幣】回答本帖問題，作者小冀-將贈(zèng)送您 62 個(gè)金幣
小冀- 版主 (著名寫手) 應(yīng)助: 713 (博后) 貴賓: 3.033 金幣: 11446.9 散金: 1055 紅花: 82 帖子: 2509 在線: 445.9小時(shí) 蟲號(hào): 1521695 注冊(cè): 2011-12-03 性別: GG 專業(yè): 生物信息學(xué) 管轄: 微生物	[求助] 與PMD-19T連接問題 已有6人參與 用PMD-19T載體與我的目的基因片段（3.3kb）鏈接，之前用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過加A試劑盒進(jìn)行加A尾，之后熱擊轉(zhuǎn)化，涂布后長出菌落，但是提質(zhì)粒鑒定后發(fā)現(xiàn)載體自連（單雙酶切條帶一樣，只有一條，有一個(gè)不一樣的，但單切有出現(xiàn)兩條條帶）；后來用一步克隆試劑盒進(jìn)行連接，但涂布后沒有菌落，一直不知道是什么原因，請(qǐng)高人指教··· 回復(fù)此樓 » 猜你喜歡 不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍” 已經(jīng)有0人回復(fù) 不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇” 已經(jīng)有0人回復(fù) 化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)? 已經(jīng)有259人回復(fù) 蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼 已經(jīng)有0人回復(fù) 不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體 已經(jīng)有0人回復(fù) 不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線 已經(jīng)有0人回復(fù) 不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千” 已經(jīng)有0人回復(fù) 不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI” 已經(jīng)有0人回復(fù) 納米粒度分析 已經(jīng)有3人回復(fù) 林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京 已經(jīng)有0人回復(fù) » 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣) » 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助: PMD 19-t和PMD 18-t那個(gè)好使 已經(jīng)有3人回復(fù) 請(qǐng)問這個(gè)物質(zhì)中Al和O是怎么連接的？ 已經(jīng)有4人回復(fù) 平末端加A尾連接T載體的問題 已經(jīng)有14人回復(fù) pMD18-T載體連接了目的片段后雙酶切鑒定出現(xiàn)了好多條帶 怎么回事? 已經(jīng)有6人回復(fù) T載體連接不上去 已經(jīng)有26人回復(fù) 載體酶切位點(diǎn)與目的片段重復(fù) 已經(jīng)有13人回復(fù) 載體為什么連不上呢 已經(jīng)有6人回復(fù) 片段總是連不到T載體上 已經(jīng)有22人回復(fù) 平末端連接不上，求助 已經(jīng)有21人回復(fù) 目的片段和pMD18-T simple vector 的連接 已經(jīng)有20人回復(fù) 目的基因的連接與轉(zhuǎn)化 已經(jīng)有3人回復(fù) T載體連接溫度和時(shí)間 已經(jīng)有7人回復(fù) pGM-T載體連接條件 已經(jīng)有8人回復(fù) 組氨酸標(biāo)簽的問題 已經(jīng)有27人回復(fù) 2174bp大小的分子片段和PMD18T都連不上，各位幫忙想想辦法哦 已經(jīng)有8人回復(fù) PMD19-T載體連接不上428bp的片段 已經(jīng)有20人回復(fù) 高保真酶PCR產(chǎn)物連接pMD-19T載體，DH5a感受態(tài)，怎么總是連接不上 已經(jīng)有26人回復(fù) pMD-19-T載體的大小是多少��？ 已經(jīng)有9人回復(fù) 大腸桿菌DH5a作感受態(tài)，PMD-19T載體連接重組的問題 已經(jīng)有3人回復(fù) PCR產(chǎn)物與T載體連不上 求助 已經(jīng)有29人回復(fù) 關(guān)于PCR產(chǎn)物與pMD 19Tsimple連接的問題 已經(jīng)有19人回復(fù) 請(qǐng)教關(guān)于寶公司pMD18T連接問題 已經(jīng)有4人回復(fù) 【求助/交流】為什么我的PCR產(chǎn)物總是連接不上T載體 已經(jīng)有26人回復(fù) 【求助/交流】連接產(chǎn)物電泳 已經(jīng)有17人回復(fù) 【求助/交流】PCR產(chǎn)物連接請(qǐng)教！ 已經(jīng)有5人回復(fù) 【求助/交流】關(guān)于T載體連接問題 已經(jīng)有22人回復(fù) 【求助/交流】請(qǐng)教關(guān)于大腸桿菌lamda RED重組問題 已經(jīng)有23人回復(fù)
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1樓 2014-06-17 08:56:49	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
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draco1987 木蟲 (正式寫手) 應(yīng)助: 47 (小學(xué)生) 金幣: 3898.1 散金: 4581 紅花: 5 帖子: 771 在線: 1064.2小時(shí) 蟲號(hào): 1139494 注冊(cè): 2010-11-05 性別: GG 專業(yè): 林木遺傳育種學(xué)	引用回帖: 17樓: Originally posted by 飛約瘋?cè)嗽?/i> at 2014-06-18 10:24:48 我們實(shí)驗(yàn)室以前用的都是18t19t，可是后來怎么都不行了，實(shí)驗(yàn)做不出來，建議你用T-easy吧，很好很適用。 Takara的T載體Kit階段性抽風(fēng)已經(jīng)不是一兩年了，習(xí)慣了吧，下個(gè)批次就好了，畢竟還是相對(duì)便宜好用。 贊一下(2人) 回復(fù)此樓
19樓2014-06-18 12:02:16	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
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Neo2000 木蟲 (著名寫手) 應(yīng)助: 639 (博士) 金幣: 8720.2 紅花: 37 帖子: 1700 在線: 269.3小時(shí) 蟲號(hào): 322365 注冊(cè): 2007-03-11 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子	★ ★ ★ ★ 小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖 小冀-: 金幣+1 2014-06-17 10:51:49 gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-06-17 15:08:09 平末端的再加A進(jìn)行ta克隆，效率本來就很低，你可以考慮用taq，循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，多擴(kuò)一點(diǎn)，回收時(shí)少加點(diǎn)水濃縮，連接時(shí)不加水多加PCR產(chǎn)物，試試，祝好 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] 贊一下 回復(fù)此樓 高級(jí)回復(fù)
2樓2014-06-17 09:40:07	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
小冀- 版主 (著名寫手) 應(yīng)助: 713 (博后) 貴賓: 3.033 金幣: 11446.9 散金: 1055 紅花: 82 帖子: 2509 在線: 445.9小時(shí) 蟲號(hào): 1521695 注冊(cè): 2011-12-03 性別: GG 專業(yè): 生物信息學(xué) 管轄: 微生物	引用回帖: 2樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07 平末端的再加A進(jìn)行ta克隆，效率本來就很低，你可以考慮用taq，循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，多擴(kuò)一點(diǎn)，回收時(shí)少加點(diǎn)水濃縮，連接時(shí)不加水多加PCR產(chǎn)物，試試，祝好 我用Ex-Taq酶做過一次，片段是P出來了，而且都說用它P的都會(huì)存在A尾，所以就直接連了，鑒定時(shí)還是沒有連上··· 贊一下 回復(fù)此樓
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3樓2014-06-17 10:51:12	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
Neo2000 木蟲 (著名寫手) 應(yīng)助: 639 (博士) 金幣: 8720.2 紅花: 37 帖子: 1700 在線: 269.3小時(shí) 蟲號(hào): 322365 注冊(cè): 2007-03-11 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子	★ 小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖 引用回帖: 3樓: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 10:51:12 我用Ex-Taq酶做過一次，片段是P出來了，而且都說用它P的都會(huì)存在A尾，所以就直接連了，鑒定時(shí)還是沒有連上···... 那說明問題出在ta克隆這一步，18t是很一般的t載體，建議用pGEM T Easy，NEB的連接酶 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] 贊一下 回復(fù)此樓
4樓2014-06-17 12:11:58	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
小冀- 版主 (著名寫手) 應(yīng)助: 713 (博后) 貴賓: 3.033 金幣: 11446.9 散金: 1055 紅花: 82 帖子: 2509 在線: 445.9小時(shí) 蟲號(hào): 1521695 注冊(cè): 2011-12-03 性別: GG 專業(yè): 生物信息學(xué) 管轄: 微生物	引用回帖: 4樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 12:11:58 那說明問題出在ta克隆這一步，18t是很一般的t載體，建議用pGEM T Easy，NEB的連接酶 ... 我也感覺是在這一步，但是又沒法解釋最后鑒定的時(shí)候載體居然都是自連的··· 贊一下 回復(fù)此樓
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5樓2014-06-17 13:55:06	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
Neo2000 木蟲 (著名寫手) 應(yīng)助: 639 (博士) 金幣: 8720.2 紅花: 37 帖子: 1700 在線: 269.3小時(shí) 蟲號(hào): 322365 注冊(cè): 2007-03-11 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子	★ 小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖 引用回帖: 5樓: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 13:55:06 我也感覺是在這一步，但是又沒法解釋最后鑒定的時(shí)候載體居然都是自連的···... 那個(gè)載體自連率是很高的，它不是都帶有t的突出末端的。我都不買他們家的載體用，命中率不好 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] 贊一下 回復(fù)此樓
6樓2014-06-17 14:27:25	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
古月木木 新蟲 (著名寫手) 應(yīng)助: 51 (初中生) 金幣: 1281.1 散金: 1325 紅花: 19 帖子: 1211 在線: 52.2小時(shí) 蟲號(hào): 1106396 注冊(cè): 2010-09-24 性別: MM 專業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)	【答案】應(yīng)助回帖 ★ ★ 感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1 小冀-: 金幣+1 2014-07-25 09:36:43 小冀-: 金幣+1, ★有幫助 2014-10-23 21:50:23 建議做藍(lán)白篩選，換ligase，直觀提高連接效率 贊一下 回復(fù)此樓
7樓2014-06-17 16:13:40	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
Neo2000 木蟲 (著名寫手) 應(yīng)助: 639 (博士) 金幣: 8720.2 紅花: 37 帖子: 1700 在線: 269.3小時(shí) 蟲號(hào): 322365 注冊(cè): 2007-03-11 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子	【答案】應(yīng)助回帖 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ 感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1 小冀-: 金幣+10, ★有幫助, 我也是的，氨芐板直接篩的··· 2014-07-25 09:37:18 小冀-: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-10-23 21:50:35 引用回帖: 7樓: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-17 16:13:40 建議做藍(lán)白篩選，換ligase，直觀提高連接效率 連接效率上去了，不做藍(lán)白斑也行，我都是直接上氨芐板篩的 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] 贊一下 回復(fù)此樓
8樓2014-06-17 17:59:44	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
古月木木 新蟲 (著名寫手) 應(yīng)助: 51 (初中生) 金幣: 1281.1 散金: 1325 紅花: 19 帖子: 1211 在線: 52.2小時(shí) 蟲號(hào): 1106396 注冊(cè): 2010-09-24 性別: MM 專業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)	引用回帖: 8樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 17:59:44 連接效率上去了，不做藍(lán)白斑也行，我都是直接上氨芐板篩的 ... 可以降低假陽性的概率，lucky to you 贊一下 回復(fù)此樓
9樓2014-06-18 08:00:05	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖
Neo2000 木蟲 (著名寫手) 應(yīng)助: 639 (博士) 金幣: 8720.2 紅花: 37 帖子: 1700 在線: 269.3小時(shí) 蟲號(hào): 322365 注冊(cè): 2007-03-11 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子	【答案】應(yīng)助回帖 ★ ★ ★ ★ ★ 小冀-: 金幣+5 2014-10-30 12:14:21 引用回帖: 9樓: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-18 08:00:05 可以降低假陽性的概率，lucky to you... 我這邊的陽性率已經(jīng)接近100%，你覺得還有必要藍(lán)白斑嗎？ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] 贊一下 回復(fù)此樓
10樓2014-06-18 09:33:20	已閱   回復(fù)此樓   關(guān)注TA 給TA發(fā)消息 送TA紅花 TA的回帖

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