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[求助]
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 已有2人參與
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親們，有誰(shuí)做無(wú)參轉(zhuǎn)錄組分析的嗎？我想請(qǐng)問(wèn)篩選基因做qPCR驗(yàn)證的時(shí)候，怎么篩選出感興趣的基因啊？從哪個(gè)角度和哪個(gè)方向篩選比較合適？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
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3樓2017-05-07 12:38:56
stone2239
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【答案】應(yīng)助回帖
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做完RNA-Seq測(cè)序之后，往往會(huì)用QPCR來(lái)驗(yàn)證一下結(jié)果。 因?yàn)镽NA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)得到的結(jié)果作為定量參考，參數(shù)的改變也會(huì)造成結(jié)果的不同。所以需要進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，表達(dá)水平的結(jié)果最終以實(shí)時(shí)定量PCR為準(zhǔn)。 一般需要驗(yàn)證基因的數(shù)目：20個(gè)左右 在驗(yàn)證時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)RNA-Seq測(cè)序結(jié)果和QPCR結(jié)果不一致的情況，遇到此類情況，因?yàn)檫@是正�，F(xiàn)象（活久見(jiàn)）。 一個(gè)事實(shí)，我們看到的很多SCI都有驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)部分，并且文章中的結(jié)果居然都是很好！很多同學(xué)心里更加捉急，為嘛我的結(jié)果不符合預(yù)期，為嘛我的結(jié)果這么挫？！ 其實(shí)呢也許作者驗(yàn)證了多個(gè)基因，結(jié)果選取了10個(gè)效果較好的，其他驗(yàn)證結(jié)果不好、與預(yù)期結(jié)果不符或者自己不能闡述清楚的部分基因則建議不在文章中呈現(xiàn)了。所以通常在文章中闡述了少數(shù)的幾個(gè)，例如10個(gè)。 具體驗(yàn)證多少個(gè)基因就要看準(zhǔn)備發(fā)表的雜志水平和要求了。一般的文章驗(yàn)證20個(gè)左右就足夠了。在RNA-Seq實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)生物學(xué)重復(fù)的，如果重復(fù)樣本間相關(guān)系數(shù)高，只需要驗(yàn)證你關(guān)心的基因就行了。 挑選基因的建議 下面介紹下挑選做驗(yàn)證的基因的一般建議： •首先，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)不只是為了驗(yàn)證而驗(yàn)證，最好還應(yīng)該有生物學(xué)意義。 所以不需要驗(yàn)證所有的基因，而是只需要驗(yàn)證個(gè)目標(biāo)或者候選基因，把從這些基因差異中得到的結(jié)論說(shuō)清楚，你就已經(jīng)是叫獸了。建議可以先從GO和KEGG的聚類分析結(jié)果入手，看看里面跟你感興趣的研究方向有關(guān)的基因是否存在差異。尤其KEGG是個(gè)強(qiáng)大數(shù)據(jù)庫(kù)，從它的圖上可以得到很多信息。 總之，RNA-Seq的研究必須結(jié)合自己的研究方向，不可能全部信息都用上的，要能結(jié)合一個(gè)生物學(xué)特點(diǎn)或者研究機(jī)制進(jìn)行深入的研究。 •其次，是挑選基因的原則 1.樣本間表達(dá)差異倍數(shù)大（log2(FC)）； 2.基因表達(dá)量高（至少在一個(gè)樣品中的表達(dá)量RPKM/FPKM大于50）； 3.基因測(cè)序深度readcount相對(duì)較高，如有些研究人員選擇readcount大于20； 4.基因長(zhǎng)度。 這幾條標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)目前沒(méi)有統(tǒng)一固定的標(biāo)準(zhǔn)，需要研究人員根據(jù)自己的研究需要進(jìn)行選擇。 這只是最開(kāi)始篩選基因的原則，等把基因找到了之后，也許這個(gè)基因設(shè)計(jì)不出來(lái)合適的引物，所以可以找到基因后還需要看看能不能按照實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出好的引物。 最后聲明一點(diǎn)，用QPCR驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果，由于兩種技術(shù)本身存在較大差異，所以建議僅關(guān)注兩種基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果變化趨勢(shì)是否一致，如上/下調(diào)變化趨勢(shì),而不是表達(dá)定量的值以及差異倍數(shù)（依然那句話，一定范圍內(nèi)的差異是不可避免的）！ |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
2樓2017-05-06 15:41:26
4樓2017-05-11 15:31:47
送紅花一朵 |
好，謝謝啦！還有一個(gè)問(wèn)題想請(qǐng)教一下，我做的是無(wú)參測(cè)序，測(cè)序出來(lái)的unigene的ID號(hào)都是測(cè)序公司自己編號(hào)，但是有unigene的核苷酸序列，而且在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中有些有注釋，我想知道根據(jù)這些怎么知道這是什么基因，以及基因的名字～ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
5樓2017-05-11 15:37:04
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