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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 綜合其他 » 轉錄組測序分析
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[求助]
轉錄組測序分析 已有2人參與
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親們，有誰做無參轉錄組分析的嗎？我想請問篩選基因做qPCR驗證的時候，怎么篩選出感興趣的基因��？從哪個角度和哪個方向篩選比較合適？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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【答案】應助回帖
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做完RNA-Seq測序之后，往往會用QPCR來驗證一下結果。 因為RNA-Seq測序數(shù)據(jù)得到的結果作為定量參考，參數(shù)的改變也會造成結果的不同。所以需要進行qPCR驗證，表達水平的結果最終以實時定量PCR為準。 一般需要驗證基因的數(shù)目：20個左右 在驗證時，往往會出現(xiàn)RNA-Seq測序結果和QPCR結果不一致的情況，遇到此類情況，因為這是正�，F(xiàn)象（活久見）。 一個事實，我們看到的很多SCI都有驗證實驗部分，并且文章中的結果居然都是很好！很多同學心里更加捉急，為嘛我的結果不符合預期，為嘛我的結果這么挫？！ 其實呢也許作者驗證了多個基因，結果選取了10個效果較好的，其他驗證結果不好、與預期結果不符或者自己不能闡述清楚的部分基因則建議不在文章中呈現(xiàn)了。所以通常在文章中闡述了少數(shù)的幾個，例如10個。 具體驗證多少個基因就要看準備發(fā)表的雜志水平和要求了。一般的文章驗證20個左右就足夠了。在RNA-Seq實驗中設計生物學重復的，如果重復樣本間相關系數(shù)高，只需要驗證你關心的基因就行了。 挑選基因的建議 下面介紹下挑選做驗證的基因的一般建議： •首先，驗證實驗不只是為了驗證而驗證，最好還應該有生物學意義。 所以不需要驗證所有的基因，而是只需要驗證個目標或者候選基因，把從這些基因差異中得到的結論說清楚，你就已經(jīng)是叫獸了。建議可以先從GO和KEGG的聚類分析結果入手，看看里面跟你感興趣的研究方向有關的基因是否存在差異。尤其KEGG是個強大數(shù)據(jù)庫，從它的圖上可以得到很多信息。 總之，RNA-Seq的研究必須結合自己的研究方向，不可能全部信息都用上的，要能結合一個生物學特點或者研究機制進行深入的研究。 •其次，是挑選基因的原則 1.樣本間表達差異倍數(shù)大（log2(FC)）； 2.基因表達量高（至少在一個樣品中的表達量RPKM/FPKM大于50）； 3.基因測序深度readcount相對較高，如有些研究人員選擇readcount大于20； 4.基因長度。 這幾條標準的指標目前沒有統(tǒng)一固定的標準，需要研究人員根據(jù)自己的研究需要進行選擇。 這只是最開始篩選基因的原則，等把基因找到了之后，也許這個基因設計不出來合適的引物，所以可以找到基因后還需要看看能不能按照實時定量引物設計原則設計出好的引物。 最后聲明一點，用QPCR驗證RNA-Seq結果，由于兩種技術本身存在較大差異，所以建議僅關注兩種基因表達的檢測結果變化趨勢是否一致，如上/下調變化趨勢,而不是表達定量的值以及差異倍數(shù)（依然那句話，一定范圍內的差異是不可避免的）！ |
2樓2017-05-06 15:41:26
yangzongying
金蟲 (正式寫手)
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3樓2017-05-07 12:38:56
4樓2017-05-11 15:31:47
送紅花一朵 |
好，謝謝啦！還有一個問題想請教一下，我做的是無參測序，測序出來的unigene的ID號都是測序公司自己編號，但是有unigene的核苷酸序列，而且在nr數(shù)據(jù)庫中有些有注釋，我想知道根據(jù)這些怎么知道這是什么基因，以及基因的名字～ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2017-05-11 15:37:04
yangzongying
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6樓2017-05-11 19:28:01
7樓2017-05-12 00:23:00
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