酶切連接不成功
酶切連接總是沒有陽性子，我的基因是菌p得來的，三個基因，我用overlap連起來總長3900bp，載體是petduet-1，酶切位點(diǎn)ecor1和hind3做了一個多月了，試過各種連接比例。我現(xiàn)在在想會不會是我目的基因有什么問題？
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可以試試一步克隆，很方便
確定同源臂設(shè)計(jì)沒問題嗎，連不起來很大部分原因是你的同源臂設(shè)計(jì)不合理
實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性，考慮做陽性對照。
1. 第一個陽性對照，PCR一個短片段（500-1000bp即可），接口酶依然是ecor1和hind3，連接載體依然是petduet-1，如果能連接不成功，說明你整個酶切/連接/轉(zhuǎn)化體系可能有問題。
2. 大片段連接和轉(zhuǎn)化的存在效率問題，你的片段+載體都有9K多了。建議你做一個對照，3900bp的片段 連 T載體（這個長度可能會有連接效率的問題，轉(zhuǎn)化效率不存在瓶頸），如果連接不成功，說明你現(xiàn)在的連接體系對于大片段的效率非常低。如果成功了，你的片段以后就不許需要通過PCR制備了，也會后續(xù)的步驟省力。
3. 9K的質(zhì)粒，熱轉(zhuǎn)如果效率不高，考慮換感受態(tài)，或者電轉(zhuǎn)。這個要看你自己實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)了，當(dāng)然也有人會告訴你，9k的質(zhì)粒一點(diǎn)也不大。
4. 我從來都是不算連接比例的，片段絕對是超量的，就算片段自連也長不出菌，