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高拷貝質(zhì)粒變成低拷貝，可能嗎？！ 已有1人參與
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最近用pGEM T-easy 構(gòu)建了一個(gè)載體（在多克隆位點(diǎn)區(qū)插入大約4kb片段），總長(zhǎng)度大約7KB，這個(gè)載體轉(zhuǎn)入DH5a能狗很好的提取質(zhì)粒，，5ML菌液可以提取50ul質(zhì)粒，濃度達(dá)到468ng/ul， 實(shí)驗(yàn)室用的是OMEGA 質(zhì)粒小提盒子，可是當(dāng)我雙酶切插入GFP（大約800bp）， 獲得陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒的時(shí)候遇到問(wèn)題了，，質(zhì)粒卻成了低拷貝，用5ml菌液最后濃度才10ng/ul, 我跟空載體同時(shí)做，發(fā)現(xiàn)空載體可以提的很好 （說(shuō)明試劑盒沒(méi)有問(wèn)題），就是插入片段的質(zhì)粒菌，濃度很低。這是什么原因？ 推測(cè)：質(zhì)粒太長(zhǎng)？！不太可能 DH5a菌株有問(wèn)題？造成裂解有問(wèn)題？！ |
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ken19860823
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菌株沒(méi)問(wèn)題，復(fù)制起點(diǎn)沒(méi)突變我覺(jué)得都不會(huì)是菌株的問(wèn)題。測(cè)序之前都要定量的，我們公司比較窮，都是肉眼定量的。我之前在武漢做的時(shí)候不會(huì)測(cè)50ng/ul以下的。因?yàn)楣居幸?guī)定，返工成功率不能低于百分之85，這種明顯寫(xiě)在測(cè)序單的硬性指標(biāo)不會(huì)有人去挑戰(zhàn)的。搖不起菌來(lái)在測(cè)序單位碰到的一般是噬菌體感染，如果你其他菌都沒(méi)問(wèn)題的話重新做一次吧，分子生物多做幾次就知道哪里出問(wèn)題了。 |
6樓2016-03-15 09:16:00
ken19860823
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2樓2016-03-11 08:10:36
3樓2016-03-11 10:02:19
ken19860823
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西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-03-15 08:54:32
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-03-15 08:54:32
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有的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒少的問(wèn)題，不過(guò)看你什么作用，10ng每微升有點(diǎn)太小，跑膠都難看出來(lái)。應(yīng)該不是拷貝的問(wèn)題，就算一個(gè)拷貝都不能那么低啊。質(zhì)粒低個(gè)五倍左右算極限了，一般這樣只要濃縮一下就行，只要測(cè)序正確，中間的問(wèn)題一般可以忽略。這里就是你10ng/ul測(cè)序都測(cè)不動(dòng)啊，測(cè)序至少50ng/ul的。樓主還是得給多一點(diǎn)有用信息。（我做過(guò)測(cè)序） |
4樓2016-03-11 12:12:47
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