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我是胡子新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助，急，跪謝！ 已有3人參與
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我準備在大腸桿菌中異源表達并純化Methanosarcina acetivorans中的acetate kinase （基因locus number為MA3606），請問： 1）該基因稀有密碼子含量如何？我該使用什么蛋白表達菌株？ 2）選擇一種pET載體，使該異源表達的蛋白帶上C末端的His tag。 3）設(shè)計一個純化方法，將該蛋白純化（注明用什么buffer，什么色譜柱，什么流速，柱與柱之間需要進行什么處理，如何檢測蛋白等）。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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簡單理解一下問題就是：我該如何表達一個蛋白？樓主你沒經(jīng)驗吧，應(yīng)該是沒做過，，， 沒做過的知道分析稀有密碼子含量很不錯， 1.稀有密碼子含量，你可以自己分析，你不是在大腸桿菌表達系統(tǒng)嘛，大腸桿菌有自己喜歡和不喜歡的密碼子網(wǎng)上一查就知道了（就是密碼子優(yōu)化的步驟）除此之外除了優(yōu)化密碼子還有mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，這就你自己搞了不同的公司有不同的技術(shù)（應(yīng)該屬于機密了吧）； 2. 你應(yīng)該用什么表達菌株，一般正常情況下 BL21（DE3）就可以了，當然如有表達的蛋白有毒性或者其他特性就另說了（可以看下這篇文章，http://www.detaibio.com/topics/yuan-he-biao-da-faq.html，看原核表達FAQ那個，7 8M的打開會有點慢，里面說的挺好）； 3. 你是原核表達 pet系列你都可以選擇，帶上his也很正常有利于純化嗎，親和純化哈 4. 純化方法？你都his了，當然親和純化，至于你說的什么流速什么buffer什么色譜柱，這個。。。。這都需要有蛋白純化工作經(jīng)驗至少一兩年以上的才能準確回答你，這些因素就是實驗摸索的一個過程，恰恰是最重要的，針對不同的蛋白性質(zhì)也不一樣，所以沒有固定答案，你還是好好學(xué)習親和純化原理，如何大概操作步驟，中間的試劑等等自己摸索，純化有時候buffer不對，結(jié)果都會千差萬別的，有時候還包涵體更麻煩，上清就好些了 5.檢測蛋白，檢測蛋白比較簡單，跑SDS-PAGE就可以，你的蛋白大小多大你是知道的，只需要在膠上面看看有沒有表達就行，沒有表達那就不好辦了，原因多種更要摸索，如果表達量低，可以在做Western blot定性一下，看看到底有沒有，實在不放心也可以切膠測序嗎，，，提供一些資料：祝好運，資料如下： 蛋白表達系統(tǒng)介紹：原核酵母哺乳動物系統(tǒng)/原理/操作步驟/FAQ SDS=PAGR實驗原理/操作步驟/相關(guān)FAQ Western blot實驗原理/操作步驟/相關(guān)FAQ 原核表達FAQ包括蛋白不表達，蛋白表達不在上清 蛋白純化：http://wenku.baidu.com/view/521ff9cec281e53a5902ff27 |
2樓2016-03-18 16:06:49
【答案】應(yīng)助回帖
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蛋白表達系統(tǒng)原核/真核/酵母/哺乳動物系統(tǒng)/原理/操作步驟/FAQ：http://www.detaibio.com/topics/dan-bai-biao-da.html 蛋白不表達，蛋白表達不在上清：http://www.detaibio.com/topics/yuan-he-biao-da-faq.html SDS-PAGE實驗原理/步驟/FAQ：http://www.detaibio.com/topics/sds-page-technology.html Western blot原理實驗操作FAQ：http://www.detaibio.com/material-western-blot.html |
3樓2016-03-18 16:10:40
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nono2009: 金幣-20, 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔, 注冊商家也只能在廣告區(qū)發(fā)廣告，其它區(qū)發(fā)廣告仍屬違規(guī) 2016-05-05 21:50:08
nono2009: 金幣-20, 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔, 注冊商家也只能在廣告區(qū)發(fā)廣告，其它區(qū)發(fā)廣告仍屬違規(guī) 2016-05-05 21:50:08
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4樓2016-05-04 11:43:08
hc-material
專家顧問 (職業(yè)作家)
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專家經(jīng)驗: +702 - BioEPI: 1
- 應(yīng)助: 517 (博士)
- 金幣: 462.9
- 散金: 18028
- 紅花: 313
- 帖子: 3594
- 在線: 518.8小時
- 蟲號: 4027804
- 注冊: 2015-08-18
- 性別: GG
- 專業(yè): 核技術(shù)及其應(yīng)用
- 管轄: 生物科學(xué)
問題太多了，太寬泛。his taq融合蛋白都用鎳螯合高流速瓊脂糖凝膠純化。具體買填料會有說明書。祝順利。 5樓2016-05-13 15:57:17
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