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BESTWWZ新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于質(zhì)粒構(gòu)建的疑難問題，求指點(diǎn)！�。。� 已有2人參與
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請(qǐng)教質(zhì)粒構(gòu)建前輩~目前我想構(gòu)建某一基因的表達(dá)載體，已從cDNA上成功調(diào)取該基因，目標(biāo)基因的大小是2000bp，想要構(gòu)建到VR1012（4900bp）這個(gè)真核表達(dá)載體上，使用PCR方法獲得酶切位點(diǎn)然后連入雙酶切的載體，PCR后核酸膠驗(yàn)證目標(biāo)條帶大小正確，膠回收，同時(shí)酶切載體膠回收，將目的基因的正義鏈與反義鏈退火（94℃ 10min, 25℃ 30min），連接載體，TOP10感受態(tài)轉(zhuǎn)化后，挑單克隆，鑒定（雙酶切以及菌液PCR）發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因變短了！  測(cè)序發(fā)現(xiàn)基因變成了△975-1431nt缺失，少了456bp，反復(fù)了3次以上都是這樣，請(qǐng)問各位大牛有人知道這種情況是如何造成的？有什么方法能避免，我用相同的方法構(gòu)建了另外4個(gè)基因都沒有這樣的問題…… |
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yvonne9044
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9樓2016-03-24 14:04:00
siriusxuan
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2樓2016-03-21 00:02:37
蘭蘭園丁
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-03-21 08:43:48
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-03-21 08:43:48
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最大的可能就是你酶切位點(diǎn)選的不對(duì)，基因內(nèi)部可能還有一個(gè)位點(diǎn)，因此導(dǎo)致變短 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-03-21 00:10:09
star013 
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4樓2016-03-21 06:03:40
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