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大腸桿菌生長(zhǎng)速度快質(zhì)粒濃度低，怎么破？ 已有7人參與
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試驗(yàn)出現(xiàn)問(wèn)題： 多次搖菌，送去測(cè)序均顯示模板濃度低，無(wú)信號(hào)。提取質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)濃度很低（100ng/ul左右），而菌液生長(zhǎng)速度很快（早8點(diǎn)搖菌，下午2點(diǎn)菌液已渾濁） 1.已經(jīng)過(guò)菌液PCR及質(zhì)粒PCR均獲得目的條帶（PCR過(guò)程中設(shè)置了對(duì)照，排除PCR過(guò)程中存在問(wèn)題） 2.開(kāi)始懷疑是載體的問(wèn)題，但更換過(guò)克隆載體，高拷貝的空載體，不同抗性的載體等，情況依舊沒(méi)有得到改善（排除載體存在問(wèn)題） 3.又懷疑是感受態(tài)的問(wèn)題，于是更換了感受態(tài)，情況依舊沒(méi)有改善(且實(shí)驗(yàn)室采用的是商業(yè)感受態(tài)，其他人也用同樣的感受態(tài)，沒(méi)有問(wèn)題） 4.再懷疑是菌活性的問(wèn)題，但挑取過(guò)新鮮的單克隆菌落，也曾使用過(guò)測(cè)序正確的甘油菌搖菌~~提取質(zhì)粒濃度低的情況還是沒(méi)有改善 5.抗生素，培養(yǎng)基，均是新鮮配制的，且與他人通用，沒(méi)有問(wèn)題 6.質(zhì)粒提取~~試劑盒提取，同樣也是與他人共用的，沒(méi)有問(wèn)題 7.我將提取過(guò)的低濃度質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑取單菌落搖菌~~~情況，還是一樣  能想過(guò)的原因都已經(jīng)找過(guò)了，至今找不到原因。百思不得其解，咨詢過(guò)周圍的人大家也表示不理解這種情況~~~ 希望小木蟲(chóng)的蟲(chóng)友們能提供幫助，不勝感激! |
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原海亮
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西門(mén)吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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西門(mén)吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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第一，不知道你送測(cè)序的時(shí)候是菌液還是質(zhì)粒呢？第二，你的菌生長(zhǎng)很快，是個(gè)什么概念，OD能到多少？有沒(méi)有試過(guò)過(guò)夜搖菌？第三，你理想中質(zhì)粒濃度應(yīng)該是多少，才可以達(dá)到你要求呢，100納克每微升我印象中也不是太低吧，電泳時(shí)，也大概和5微升marker最亮的條帶差不多吧？可以做個(gè)酶切看看質(zhì)粒條帶，最好上圖。第四，樓主可以試一試不加抗搖菌，驗(yàn)證正確的克隆注意操作，一般不會(huì)污染雜菌。最后，實(shí)驗(yàn)中其實(shí)最怕糾纏糾結(jié)，也有和樓主一樣的經(jīng)歷，特別是做很多工作來(lái)驗(yàn)證自己這個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程是錯(cuò)誤的，追根刨底的想知道為什么，但其實(shí)是我們太自信的把很多可能性給否定了，對(duì)于樓主這樣情況，建議還是抓緊找其他方法測(cè)序驗(yàn)證克隆最重要，送菌液不行那就送質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度低就延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間或者加大菌液量，質(zhì)粒還不行就用特異引物直接把目的基因擴(kuò)增下來(lái)，送pcr產(chǎn)物測(cè)序……對(duì)于質(zhì)粒濃度問(wèn)題，我覺(jué)得只要不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，就繼續(xù)進(jìn)行下去，祝好！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
4樓2016-04-10 11:10:26
科研蟲(chóng)洞人
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【答案】應(yīng)助回帖
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根據(jù)你說(shuō)的問(wèn)題，我覺(jué)得很有可能是你用的培養(yǎng)基抗性不足，導(dǎo)致最后挑的克隆是雜菌。 菌落PCR鑒定很容易有假陽(yáng)性。一般氨芐的終濃度要100ug/ml，卡那霉素要50ug/ml，配置時(shí)需要培養(yǎng)基的溫度不燙手時(shí)再加入抗生素，而且含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)板不能放置超過(guò)一個(gè)月。 建議你在菌PCR陽(yáng)性的基礎(chǔ)上加做酶切鑒定，如果酶切鑒定都正確，一般不會(huì)測(cè)序測(cè)不出來(lái)。 估計(jì)你提的質(zhì)粒做酶切不一定是陽(yáng)性。 我總是跟學(xué)生說(shuō)，培養(yǎng)基要自己配，抗生素要用自己的，不要相信別人的東西。我們實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生最近總是有這樣類似的問(wèn)題。希望對(duì)你有所幫助。 |
20樓2016-04-13 15:34:19
匿名
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2樓2016-04-09 23:15:07
Anu0103
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3樓2016-04-10 00:04:44
5樓2016-04-10 21:11:43
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送測(cè)序菌液和質(zhì)粒都嘗試過(guò)，結(jié)果都是無(wú)信號(hào)。曾經(jīng)送樣26個(gè)只測(cè)出來(lái)2個(gè)（不同載體的多個(gè)樣品）。曾經(jīng)嘗試過(guò)過(guò)夜搖菌，OD2.1，曾經(jīng)提取質(zhì)粒濃度至少達(dá)到七八百納克每微，后來(lái)方法藥品沒(méi)變，某天突然就變成現(xiàn)在這種情況了。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間加大菌量等都嘗試過(guò)～你說(shuō)的送PCR產(chǎn)物測(cè)序我不明白是什么意思？因?yàn)榧词筆CR產(chǎn)物里也會(huì)混雜完整或不完整的擴(kuò)增片段，這樣如何保證我后期載體構(gòu)建時(shí)是正確的擴(kuò)增片段與載體連接呢？ |
6樓2016-04-10 21:19:33
7樓2016-04-11 21:44:06
王冠傑
鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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菌留一部分流行，把另一部分做菌p后測(cè)序。如果測(cè)序結(jié)果沒(méi)問(wèn)題說(shuō)明你的菌可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，有問(wèn)題的話再分析嘍 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
8樓2016-04-11 22:56:55
表弟愛(ài)網(wǎng)游
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-04-13 09:44:18
| 6個(gè)小時(shí)確實(shí)短了點(diǎn)，你用的什么培養(yǎng)基？長(zhǎng)得太快，質(zhì)粒確實(shí)會(huì)少一點(diǎn)，但是100ng已經(jīng)濃度已經(jīng)不低了，測(cè)序足夠了。普通LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)，大腸桿菌搖菌夠提質(zhì)粒。你可以送一份空載測(cè)序，看看是不是測(cè)序公司的問(wèn)題。 |
9樓2016-04-12 09:13:04
九根手指
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