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[求助]
大腸桿菌生長速度快質(zhì)粒濃度低，怎么破？ 已有7人參與
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試驗出現(xiàn)問題： 多次搖菌，送去測序均顯示模板濃度低，無信號。提取質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)濃度很低（100ng/ul左右），而菌液生長速度很快（早8點搖菌，下午2點菌液已渾濁） 1.已經(jīng)過菌液PCR及質(zhì)粒PCR均獲得目的條帶（PCR過程中設(shè)置了對照，排除PCR過程中存在問題） 2.開始懷疑是載體的問題，但更換過克隆載體，高拷貝的空載體，不同抗性的載體等，情況依舊沒有得到改善（排除載體存在問題） 3.又懷疑是感受態(tài)的問題，于是更換了感受態(tài)，情況依舊沒有改善(且實驗室采用的是商業(yè)感受態(tài)，其他人也用同樣的感受態(tài)，沒有問題） 4.再懷疑是菌活性的問題，但挑取過新鮮的單克隆菌落，也曾使用過測序正確的甘油菌搖菌~~提取質(zhì)粒濃度低的情況還是沒有改善 5.抗生素，培養(yǎng)基，均是新鮮配制的，且與他人通用，沒有問題 6.質(zhì)粒提取~~試劑盒提取，同樣也是與他人共用的，沒有問題 7.我將提取過的低濃度質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑取單菌落搖菌~~~情況，還是一樣  能想過的原因都已經(jīng)找過了，至今找不到原因。百思不得其解，咨詢過周圍的人大家也表示不理解這種情況~~~ 希望小木蟲的蟲友們能提供幫助，不勝感激! |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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第一，不知道你送測序的時候是菌液還是質(zhì)粒呢？第二，你的菌生長很快，是個什么概念，OD能到多少？有沒有試過過夜搖菌？第三，你理想中質(zhì)粒濃度應(yīng)該是多少，才可以達(dá)到你要求呢，100納克每微升我印象中也不是太低吧，電泳時，也大概和5微升marker最亮的條帶差不多吧？可以做個酶切看看質(zhì)粒條帶，最好上圖。第四，樓主可以試一試不加抗搖菌，驗證正確的克隆注意操作，一般不會污染雜菌。最后，實驗中其實最怕糾纏糾結(jié)，也有和樓主一樣的經(jīng)歷，特別是做很多工作來驗證自己這個實驗過程是錯誤的，追根刨底的想知道為什么，但其實是我們太自信的把很多可能性給否定了，對于樓主這樣情況，建議還是抓緊找其他方法測序驗證克隆最重要，送菌液不行那就送質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度低就延長培養(yǎng)時間或者加大菌液量，質(zhì)粒還不行就用特異引物直接把目的基因擴(kuò)增下來，送pcr產(chǎn)物測序……對于質(zhì)粒濃度問題，我覺得只要不影響實驗結(jié)果，就繼續(xù)進(jìn)行下去，祝好！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-04-10 11:10:26
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【答案】應(yīng)助回帖
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根據(jù)你說的問題，我覺得很有可能是你用的培養(yǎng)基抗性不足，導(dǎo)致最后挑的克隆是雜菌。 菌落PCR鑒定很容易有假陽性。一般氨芐的終濃度要100ug/ml，卡那霉素要50ug/ml，配置時需要培養(yǎng)基的溫度不燙手時再加入抗生素，而且含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)板不能放置超過一個月。 建議你在菌PCR陽性的基礎(chǔ)上加做酶切鑒定，如果酶切鑒定都正確，一般不會測序測不出來。 估計你提的質(zhì)粒做酶切不一定是陽性。 我總是跟學(xué)生說，培養(yǎng)基要自己配，抗生素要用自己的，不要相信別人的東西。我們實驗室的學(xué)生最近總是有這樣類似的問題。希望對你有所幫助。 |
20樓2016-04-13 15:34:19
匿名
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【答案】應(yīng)助回帖
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菌留一部分流行，把另一部分做菌p后測序。如果測序結(jié)果沒問題說明你的菌可以進(jìn)行下一步實驗，有問題的話再分析嘍 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
8樓2016-04-11 22:56:55
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9樓2016-04-12 09:13:04
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