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大腸桿菌生長速度快質(zhì)粒濃度低，怎么破？ 已有7人參與
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試驗(yàn)出現(xiàn)問題： 多次搖菌，送去測序均顯示模板濃度低，無信號(hào)。提取質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)濃度很低（100ng/ul左右），而菌液生長速度很快（早8點(diǎn)搖菌，下午2點(diǎn)菌液已渾濁） 1.已經(jīng)過菌液PCR及質(zhì)粒PCR均獲得目的條帶（PCR過程中設(shè)置了對照，排除PCR過程中存在問題） 2.開始懷疑是載體的問題，但更換過克隆載體，高拷貝的空載體，不同抗性的載體等，情況依舊沒有得到改善（排除載體存在問題） 3.又懷疑是感受態(tài)的問題，于是更換了感受態(tài)，情況依舊沒有改善(且實(shí)驗(yàn)室采用的是商業(yè)感受態(tài)，其他人也用同樣的感受態(tài)，沒有問題） 4.再懷疑是菌活性的問題，但挑取過新鮮的單克隆菌落，也曾使用過測序正確的甘油菌搖菌~~提取質(zhì)粒濃度低的情況還是沒有改善 5.抗生素，培養(yǎng)基，均是新鮮配制的，且與他人通用，沒有問題 6.質(zhì)粒提取~~試劑盒提取，同樣也是與他人共用的，沒有問題 7.我將提取過的低濃度質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑取單菌落搖菌~~~情況，還是一樣  能想過的原因都已經(jīng)找過了，至今找不到原因。百思不得其解，咨詢過周圍的人大家也表示不理解這種情況~~~ 希望小木蟲的蟲友們能提供幫助，不勝感激! |
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Anu0103
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3樓2016-04-10 00:04:44
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2樓2016-04-09 23:15:07
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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第一，不知道你送測序的時(shí)候是菌液還是質(zhì)粒呢？第二，你的菌生長很快，是個(gè)什么概念，OD能到多少？有沒有試過過夜搖菌？第三，你理想中質(zhì)粒濃度應(yīng)該是多少，才可以達(dá)到你要求呢，100納克每微升我印象中也不是太低吧，電泳時(shí)，也大概和5微升marker最亮的條帶差不多吧？可以做個(gè)酶切看看質(zhì)粒條帶，最好上圖。第四，樓主可以試一試不加抗搖菌，驗(yàn)證正確的克隆注意操作，一般不會(huì)污染雜菌。最后，實(shí)驗(yàn)中其實(shí)最怕糾纏糾結(jié)，也有和樓主一樣的經(jīng)歷，特別是做很多工作來驗(yàn)證自己這個(gè)實(shí)驗(yàn)過程是錯(cuò)誤的，追根刨底的想知道為什么，但其實(shí)是我們太自信的把很多可能性給否定了，對于樓主這樣情況，建議還是抓緊找其他方法測序驗(yàn)證克隆最重要，送菌液不行那就送質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度低就延長培養(yǎng)時(shí)間或者加大菌液量，質(zhì)粒還不行就用特異引物直接把目的基因擴(kuò)增下來，送pcr產(chǎn)物測序……對于質(zhì)粒濃度問題，我覺得只要不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，就繼續(xù)進(jìn)行下去，祝好！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-04-10 11:10:26
5樓2016-04-10 21:11:43
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