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wo00wo2新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求幫助�。�！求告知關(guān)于做膜蛋白的表達(dá)，分離和純化的具體步驟�。�！ 已有2人參與
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 我正在做變形菌視紫紅質(zhì)在重組細(xì)胞上的表達(dá)，純化和分離的本科畢業(yè)論文。感受態(tài)細(xì)胞是大腸桿菌，對于我是零基礎(chǔ)重新開始，我完全是菜鳥一個，可以告訴我詳細(xì)的純化，分離做法嗎？尤其是用qiagen公司的NI-NTA Agarose 25ML做柱層析，怎么裝柱，裝多少，怎么洗？我知道用蛋白濃度算填料多少，可是蛋白濃度怎么得到？我現(xiàn)在只做到了誘導(dǎo)蛋白在重組細(xì)胞上表達(dá)了。麻煩一定要詳細(xì)一點(diǎn)簡單一點(diǎn)，我這是第一次接觸生物化學(xué)，本科是學(xué)化學(xué)的55555555.。。。。。。。。。。。。謝謝了，急用�。。。�！ |
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moychan
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裝柱你有空柱子嗎？有的話，把填料混勻直接加到柱子里就可以了，然后用蠕動泵或者重力都可以，讓液面緩慢下降到填料上界面時，加平衡液平衡填料，再然后把你提到的細(xì)胞粗提物加到填料里，接著用平衡液再次洗柱子，然后用含咪唑的平衡液洗填料的同時接洗脫液。洗脫液里就有你要的蛋白。蛋白濃度可以測A280的吸光值來確定，或者有BCA蛋白濃度測定試劑盒也可以 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-04-25 19:38:20
wo00wo2
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3樓2016-04-26 11:05:08
moychan
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4樓2016-04-26 20:59:08
moychan
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5樓2016-04-26 21:01:16
【答案】應(yīng)助回帖
| 那個，我先告訴你，如果是膜蛋白的話，用原核大腸桿菌系統(tǒng)是沒法做的，全球基本上是沒有人能夠用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)出膜蛋白的，膜蛋白用真核表達(dá)系統(tǒng)才能表達(dá)，用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)或酵母蛋白表達(dá)都可以，就算現(xiàn)在有人用大腸桿菌表達(dá)出膜蛋白了，那你是沒有經(jīng)驗(yàn)的也很難，再說蛋白表達(dá)的過程太長考慮的點(diǎn)太多，從基因序列密碼子優(yōu)化，載體選擇，感受態(tài)選擇，表達(dá)條件優(yōu)化等每個過程都有要注意的點(diǎn)，但是現(xiàn)在你的第一步是選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，可以參考資料：蛋白表達(dá)專題，包括原理，SOP相關(guān)FAQ：http://www.detaibio.com/topics/dan-bai-biao-da.html |
6樓2016-04-27 16:57:51
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nono2009: 金幣-20, 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔, 注冊商家也只能在廣告區(qū)發(fā)廣告，其它區(qū)發(fā)廣告仍屬違規(guī) 2016-05-05 22:05:09
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7樓2016-05-04 10:24:19
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