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半仙0356新蟲 (正式寫手)
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[求助]
反轉(zhuǎn)錄和PCR問題╭(°A°`)╮ 已有2人參與
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自己提的RNA,濃度1500左右.OD值1.90,用thermo的反轉(zhuǎn)錄盒子,先加8.5μLDEPC水,3μLRNA模板,1μL隨機(jī)引物,65度5分鐘后,再加入buffer4μL,dNTP 2μL,酶1μL,酶抑制劑0.5μl,42度2小時(shí),70度10分鐘,然后用actin和GAPDH內(nèi)參PCR,Tm值分別為57/59度,但是電泳后啥也沒有,怎么回事兒?求解~ @biostar2009 @wizardfan 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
新蟲 (正式寫手)
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首先你得有個(gè)引物正確括增出來的正對照,做實(shí)驗(yàn)不放對照都是耍流氓,讓我們沒法猜; 看你的體系,RNA如果是NanoDrop測定的話,1500左右的單位是什么?ug / ml或等價(jià)的ng/ul ?還是其它?如果是的話,你的RNA用量有點(diǎn)兒高。還有對于隨機(jī)引物的描述不理解,如果是隨機(jī)引物我們的反轉(zhuǎn)錄條件不是這樣,是不是混合引物(6-mer隨機(jī)引物+Oligo dT)?65℃后冰上的chill呢? 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |

新蟲 (正式寫手)
木蟲 (著名寫手)
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